Способ определения внешнесредовых мутагенных воздействий

(51) 4 С 12 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯАВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ юл. У 6 ицинской генетики Содес уровень сестринских бменов и по разницестинным спонтаннымяют мутагенные возд м ныхбщим ипредеЕ междууровнем йстви ре ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ(71) Институт медАИН СССР(56) Ргоягеяя алс 1 Торился дп Спег 1 ся чо 1. 2, яег. Ей., АчегуБапйЬеге, "Бхяг 1 г сЬгоаагЫ ех8 е", А 1 цп К, Е 1 яя 1 пс, Нею Зо1982.(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВНСРЕДОВЬИ МУТАГЕННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙвключающий определение в культ клеток общего уровня, сестринских хроматидных обменов, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения точности определения влияния внешнесредовых мутагенных факторов на индивида, воздействие мутагеном осуществляют.при условии, если клетки проходят хотя бы одно клеточ" ное деление, за которое происходитарация повреждений в клетке в е сестринских хроматидных обмеполучают истинный спонтанный11751 30 35 40 45 50 55 Йзобретение относится к медицине,в частности к разделу профессиональной гигиены.Цель изобретения - повышение точности определения влияния внешнесредовых мутагенных Факторов индивида.Способ предусматривает учетсестринских хроматидных обменов(СХО), при этом общий уровень СХОсостоит из двух компонентов: внутренних Факторов индивида и внешнесредовых, который измеряют у данного индивида на момент забора у него крови. Эту величину определяютпутем добавления БДУ (5-бромдезоксиуридина) только в начале культивирования (на 0 часу). После одногоили нескольких циклов репликацииДНК и отсутствии инешнесредовыхвоздействий в культуре лимфоцитои 20исходный уровень инешнесредоиых воздействий репарируется. При позднемдобавлении (БДУ) (на 60 часу культивирования) фиксируется только истинный. спонтанный уровень СХО индивида, 25Разница этих двух величин и составляет часть СХЭ, связанную с внешне.;средовым воздействием,П р и м е р. Обследуют группу ,новорожденных и взрослых, контактирующих с инешнесредоиыми воздействиями (лекарственные препараты, курение, алкоголь, выхлопные газы и т,д.). У новорожденных детей кровь берут из пуповины при рождении ребенка, у взрослых - из локтевой вены. Лимфоциты крови культивируют по методу Напяег Йогй (1965), а именно: к 0,5 мл цельной крови добавляют 1,5 мл сыворотки крупного рогатого скота и 6 мл среды Игла. Для стимуляции лимфоцитов к делению к 8 мл культуры добавляют 0,02 мл фитогемагглютинина (МЕсо "р"), Культуры помещают в термостат (37 С). Для каждого индивида ставят 2 культуры из одного и того же образца крови, взятой из локтевой вены у взрослых (3-5 мл), или крови пуповины (3-5 мл) после отделения новорожденного от плаценты. В первую культуру БДУ вводят на 0 часу культивирования и фиксируют на 72 часу, К этому часу наблюдают максимальное число клеток 65 2П-го деления, Для разных индивидов частота их составляет от 30 до 607 от всех митозои. Во вторую культуру (которая для предложенного способа является существенным элементом, а не дополнительным вариантом) БДУ добавляют на 60 часу культивирования, когда основная часть клеток проходит одно деление, Клетки второй культуры фиксируют. За 2 ч до Фиксации (любого иарианта) в культуру добавляют колхицин до конечной концентрации 0,5 мкг/мл, затем культуральную жидкость с клетками (8 мл) помещают в центрифужные пробирки и центрифугируют и центрифуге ЦЛК6 мин при 1500 об/мин. После этого супернатант удаляют, оставляя над осадком 0,5 мл жидкости. Клетки ресуспьндируют, приливают к ним до 10 мл 0,57-ный раствор хлористого калия, перемешивают и помещают на 6 мин в термостат (37 С). После этого пробирки центрифугируют при указанных режимах. Супернатант удаляют, а клетки ресуспендируют в 0,5 мл оставшейся жидкости, К этой суспензия приливают 6 мл фиксатора, состоящего из 3 частей метанола и 1 части ледяной уксусной кислоты иоохлажденного до 0-4 С. После перемешииания пробирки помещают на 15 мин в холодильник, а затем цент" рифугируют при прежних режимах, супернатант удаляют и добавляют свежий фиксатор. Эту продедуру (промывку) проводят 2 раза. После этого суспензию клеток объемом 0,3 мл раскапывают на влажные охлажденные стекла и высушивают на воздухе и . над пламенем горелки, не допуская возгорания метанола. Высушенные в течение 24 ч при 37 С препараты окрашивают следуюощим образом: на 10 мин помещают в водный раствор акридина оранжевого (10 М), промывают водой и высушивают. Затем препараты тонким слоем 0,07 И раствора ИаНР 04 и облучают 15 мин ультрафиолетовой лампой СВДА (ДРШ) на расстоянии 30-40 см. После облучения препараты промывают и проточной воде и обрабатывают в на ыщенном растворе гидроокиси бария при комнатной температуре и течение 5 мин. ПрепаратыВРедактор П.Горькова Техред М.Пароцай Корректор Л.Пилипенко Заказ 658/2 Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж"35, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 промывают и высушивают, а затем. окрашивают 27.-ным раствором Гимза, приготовленным на фосфатном буфере 1175165 4.(рН 6,8) в течение 10 мин. Послеокраски препараты споласкивают водойи высушивают.