Способ связывания глобулярных белков с проционовыми красителями

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССОРпп ппппп пкпюппп п ппппппОПИСАНИЕ ИЗО 00/28-13(71) Институт биологическки АН СССР(56) . Лихтенщтеин Г.И.,ров А.П., Смолина Н.Б. Изструктурных переходЬв в сыных альбумипах методом люактивных меток.-Ъолекулягия", 1968, т.2, с.291-30 ои з К АВТОРСЙСЭ 6 Пивов а чение ворото минисцеи ная биа С:01 Ы 1/3 О ТЕН но о-. РЕ ИЯ . / ТВУр (54)(57) СПОСОБ СВЯЗЫВАНИЯ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ С ПРОЦИОНОВЫИИ КРАСИТЕЛЯМИ путем инкубации водного раствора белка с красителем, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью повышения прочности связывания, белок с красителем смешивают в молярном соот ношении 1:35 - 1:45, доводят рН смеси до 2,0 - 2,5, после инкубации проводят обратимое осаздение белка, далее белок растворяют и последовательно инкубируют при рН 6,8-7,0, а затем нри рН 90-110 до максимального связывания белка с красителем.1 . 11241Изобретение относится к способам химической модификации белковых молекул, а именно к способам окраски белков процноновыми красителями, и может быть использовано в биохимии, молекулярной биологии, клинико-экспериментальной медицине и биотехнологии.Известен способ связывания глобулярных белков с проционовыми краси- О телями путем инкубации водного раствора белка с красителем, заключающийся в том, что смесь окрашиваемо" го белка с проционовым красителем в водной среде инкубируют при перемешивании в условиях поддержания стабильной в течение всего процесса окрашивания активной кислотности в диапазоне рН 3,4-9,8 и при стабильной в течении всего процесса окрашивания температуре в диапазоне 1,5-41 С, Инкубацию продолжают до 24 ч. Затем окрашенный белок выделяют от свободного красителя фильтрацией в колон. ке с сефадексом С - 25 или.С"50Однако известный способ не обеспечивает прочного (ковалентного) свяэывания молекул красителя с молеку" лами белка.Целью изобретения является повышение прочности связывания красителя с белком.Укаэанная цель достигается тем, что согласно способу связывания глобулярных белков с проционовЫми кра- сителями путем инкубации водного раствора белка с Красителем, белок с красителем смешивают в молярном соотношении 1:35"1:45, доводят рН смеси до 2,0-2,5, после инкубации проводят обратимое осаждение белка, далее белок растворяют и последовательно инкубируют .при рН 6,8-7,0, а затем при рН 9,0-11,0 до максимального связывания белка с красителем.ф45П р и м е р . Окрашивание лактатдегидрогеназы (молекулярная масса 00000-35000, р 1 4,5) проционовым красителем печатающим зеленым В. Навеску белка (20 мг) растворяют 0 в 2 мп 0,15 М БаС 1, Добавляют 4,8 мг красителя (молярное соотношение белок: краситель составляет 1:40). Смесь тщательно перемешивают. Посредством 0 2 н.НС 1 рН раствора доводятЭФ до 2,3. Раствор инкубируют при 4 С в течение 5 мин. Дпя высаливания белка доводят рН посредством 0,5 н.НаОН 98 3до 7,0 и добавляют при тщательном перемешивании 0,5 г сульфата аммония. Высоленный белок, содержащий нековалентно связанный краситель, отделяют центрифугированием при 4000 об/мин, 20 мин, 4 С.Белковый осадок вновь растворяют в 2 мл 0,15 М БаС 1 ( рН 7,0), .Раствор диализируют против 500 мл 0,15 М ЮаС 1 (рн 7,0), содержащих 150 мг исходного свободного красителя, в течение 2 ч для удаления остатков высаливающего агента. Для ковалентного свяэывания красителя диалиэованный раствор белка инкубируют при рН 6,9, добавив в раствор 40 мг трис-буфера и концентрированной НС 1 (данное значение рН соответствует рК имидаэольных групп гистидиновых остатков в составе белка). Раствор инкубируют при 37 С в течение 4 ч, а затем - при комнатной температуре в течение 1 О ч. Для ковалентного связывания красителя по месту Н-концевых аминогрупп и аминогрупп лиэиновых остатков в составе белка в раствор добавляют еще 40 мг трис-буфера и несколько капель 0,2 н.НС 1 до рН 10,0, Инкубируют этот раствор при комнатной температуре в течение 4 ч, а затем - при 7 С в течение 24 ч. Для очистки окрашенного белка от свободного красителя раствор фильтруют через сефадекс С - 75 (колонка 40 .1,0 см ), используя в качестве элюирующего растворителя 0,15 М НаС 1(рН 1 0,0), и лиофилизируют. При троекратном воспроизведении данного опыта содержание ковалентного связанного красителя в бел-, ке составляло в среднем 12,87 (в расчете на массу белка).При спектрофотометрическом анализе растворов белков окрашенных предлагаемым способом, в 0,15 М БаС 1 (рн 7,0) максимум поглощения, света белковыми растворами оказывается сдвинутым в длинноволновую область в сравнении с максимумом поглощения света растворами соответствующих свободных красителей. При Фильтрации окрашенных белков через сефадекс С"100 или Скрасители остаются . связанными с белками. Остаются связанными с белками красители при дискэлектрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, причем электрофоретическая подвижность окрашенных белков (например, подвижность окрашенного процио"3 1124198 ном ярко-синим сывороточного альбуми на н его субфракций) практически не отличается от подвижности соответствующих неокрашенных белков, для выявления которых на фореграммах при меняли обычную фиксацию и окраску кумасси ярко-синим С. При экстракции окрашенных предлагаемым способом белков диметилформамидом, этанолом или смесью пиридина, муравьиной 10 кислоты и воды красителя остаются связанными с белками.При осуществлении связывания проционовых красителей с сывороточным альбумином по известному способу 1 15 путем инкубации смеси красителя и белка при рН 6,2 и температуре 20-4 дС в течение 1-24 ч с последующей очисткой белка фильтрацией через сефадекс 6-75, сывороточный альбумин пол-.И ностью освобождается от связанного красителя, например, при электрофоретическом фракционировании в полиакриламидиом геле в присутствии додецилсульфата натрия. 25Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить прочность связывания проционовых красителей с глобулярными белками, обеспечивая ковалентное связывание белков с красите лями.Белки, связанные с проционовыми красителями по предлагаемому способу, могут оыть использованы в клинической медицине для изучения компартментализации и метаболизма белковых гидролизатов, вводимых в организм в составе препаратов для парентеральиого питания, плавмозамещающихи деэинтоксикационных растворов;оценки эффективности и надежностиполупроницаемых мембран, используемых при гемодиалиэе; оценки эффективности лечебного электпофореза ферментов (электроэнзимотерапия); оценки проницаемости кишечной стенки поотношению к белкам и продуктам ихгидролиза с оценкой роли экэогенных белков в жтиопатогенезе пищевойидиосинкразии, изучения реакцийантителообраэования и рецепции антител; определения oротеолитическойактивности ферментов, проведениядиагностического электрофореэа сколичественной оценкой получаемыхбелковых фракций беэ какой-либо фиксации и окраски фореграмм; оценкистерильности помещений, оборудования, инструментов и препаратов нвииспользовании микроорганизмов, содержащих меченые красителем белки илипродукты гидролиза окрашенных белков, а также могут быть использованы для решения ряда задач oо исследованию свойств белков в экспериментальной медицине и биологии. Составитель Н. ГуляеваТехред Л.Коцюбняк Редактор М.Бандура Корректор Г.Решетник Подписное филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 Заказ 8271/33 Тираж 822 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5