Способ получения конъюгированных антигенов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 1 К 39/00 ОЛИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ.К АВТОРСКОМЪГ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕЧВ 1 ИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Научно-исследовательский институт побиологическим испытаниям химических соединений(54) (5) 1. СПОСОБ ПОЛЧ 1:НИЯ КОНЪЮГИРОВАННЫХ АНТИГЕНОВ путем модификации полициклических ароматических углеводородов с последующим взанмодеиствием модифицированных углеводородовс сывороточным альбумином при рН 7 - 8в водно-диоксановой среде, отличающийся. тем, что, с целью упрощения процесса, модификацию полициклических ароматическихуглеводородов проводят обработкой надкислотами, а общее массовое соотношение полициклнческого ароматического углеводорода,надкнслоты и альбумина составляет :(0,6 -- 4): ( - 3),2. Способ по п. 1, отличающийся тем, чтов качестве полициклических ароматическихуглеводородов используют бензпирен илпЗ-метилхолантрен.Недостатком этого способа получени конъюгированных антигенов является дли тельность и трудоемкость процесса. Реак циоииоспособное производное углеводородов получают в несколько стадий Кроме того, в способе необходима очистка промежуточных производных, применение в ходе синтеза большого количества растворителей, концент 1 рированных кислот и токсичных веществ (фосген),50 55 Изобретение относится к иммунохимии, конкретно к способу получения конъюгированных антигенов (полициклический ароматический углеводород - антигенный носитель), которые могут найти применение в медицине и биологии для получения антител к канцерогенным полициклическим аромати.ческим углеводородам, нейтрализация канцерогенного действия углеводородов и для определения их концентрации и локализации в жидкостях и тканях организма.0Известны способы получения конъюгитов белков и ниэкомолекулярных веществ-гаптенов, в которых два компонента соединены через диазосвязь 11.Однако способ характеризуется недостаточно прочной связью при конъюгации полициклических ароматических углеводородов.Наиболее близким по технической сущ- ности и достигаемому положительному эффекту к изобретению является способ полу- щ 0 чения конъюгированных антигенов путем модификации полициклических ароматических углеводородов с последующим взаимо. действием модифицированных углеводородов с сывороточным альбумином прн рН 7 - 8 в водно-диоксановой среде при весовом соотношении соответственно (0,1 - 0,35):1.В качестве модифицированных производных полициклических ароматических углеводо. роМов используют их изоцианатные произ-: водные, Модификацию ароматических угле-,З 0 водородов проводят следующим образом. Для введения реакционноспособной группы углеводороды нитруют избытком концентрированной азотной кислоты, полученное нитропроизводное очищают перекристаллизацией из смеси бензол-лигроин н затем восстанавливают водородом или хлоридом олова в концентрированной соляной кислоте до соответствующих аминопроизводных. Аминопроизводные углеводородов очищают экстракцией из аммиачного раствора бенэолом и кристаллизацией иэ лигроина. Далее ами нопроизводные растворяют в бензоле и об.рабатывают 10 - 16-кратным избытком фосгена в толуоле. После упаривания растворителей получают реационноспособные изоцианатные производные углеводородов, 45 Очистку полученных конъюгированных анти- генов обычно производят повторным пере- осаждением сульфатом аммония нли ацето.ном с последующим диализом. Целью изобретения является упрощениепроцесса,Поставленная цель достигается тем, чтосогласно способу получения конъюгированных антигенов путем модификации полицик.лических ароматических углеводородов споследующим взаимодействием модифицированных углеводородов с сывороточнымальбумнном при рН 7 - 8 в водно-диоксановой среде, модификацию полициклическихароматических углеводородов проводят обработкой надкислотами, а общее массовоесоотношение полициклического ароматического углеводорода, надкислоты и альбуминасоставляет 1: (О,б - 4): (1 - 3),В качестве полициклических ароматичес-.ких углеводородов используют бензпиренили З-метилхолантрен.Способ осуществляется следующим образом.Реакционноспособное производное углеводородов получают в одну стадию их инкубированием с избытком надкислоты в ди.оксане при 0 - 25 С в течение 24 ч в темноте,Далее реакционноснособное производное углеводородов без стадии выделения добавляют по каплям к перемешиваемому раствору белка в фосфатном буфере при рН 7 - 8. Смесь перемешивают 24 ч.при 0 - 25 С. Получеиный конъюгированный антиген отделяют от низкомолекулярных примесей гельфильтрацией на сефадексах. Содержание углеводородов вконъюгатах определяютспектрофотометрически по интенсивности поглощения в области 30000 в 240 смсравнением экстинкции эталонных растворовуглеводородов с экстинкцией растворов полученных конъюгатов. В зависимости отсоотношения реакционноспособного произ.водного углеводорода и белкового носителя,введенных в реакцию, получают конъюгированные антигены, содержащие от 2 до 20 молекул углеводорода на молекулу носителя В предлагаемом способе по сравнению с известным упрощена технология (проведение реакции в две стадии вместо четырех беэ очистки и выделения промежуточных продуктов, исключение целого ряда реагентов и растворителей, убыстрение процесса в 3 раза) за счет использования другого приема активирования (введения реакционноспособной группы углеводорода для конь. югирования с белком), а также установле. ния режима осуществления процесса. Соотношение реакционноспособного производного углеводорода и белка 1:(1 - 3) в реакции конъюгировання выбрано в таких пределах, при которых получают конъюгированный антиген оптимального качества, т. е. содержащий от 2 до 20 моль углеводорода на 1 моль белка. При меньшем количестве углеводорода в конъюгате ухудшаются его анти- генные свойства, при замещении большем, чем 20 моль углеводорода на 1 моль белка,.Ужгород, ул. Проектная, 4 ВНИИПИ Заказ 6171/7Филиал ППП Патент, г. ухудшается растворимость конъюгированного антигена, а также возможны нежелательные побочные явления при иммунизацииживотных. Выбранный интервал температурпозволяет проводить реакцию конъюгирования с достаточной скоростью при стабильности белкового носителя.Пример 1, Получение конъюгированногоантигена бензпирен - - бычий сывороточныйальбум ин.5 мг (2,1 10 М) 3,4-бензпирена растворяют в 0,5 мл сухого диоксана, добавляют7 мг (4,2 10 5 М) м-хлорнадбензойной кислоты и смесь инкубируют 24 ч при комнатнойтемпературе. Полученный раствор реакционноспособного производного бензпирена покаплям при перемешивании приливают краствору 15 мг бычьего сывороточного альбумина в 5 мл фосфатного буфера, рН 7,4.Через сутки полученный конъюгированныйантиген очищают от низкомолекулярных примесей гель-фильтрацией на сефадексе б.Спектрофотометрически определено, что содной молекулой белка в конъюгированномантигене ковалентно связаны 2 - 3 молекулыбензпирена.Пример 2; Получение конъюгированногоантигена безпи рен - человеческий сывороточный альбумин.К 5 мг (2,1 10 5 М) 3,4-6 ензпирена в0,5 мл сухого диоксана добавляют 10 мг(6,3 10 а М) м-хлорнадбензойной кислоты,смесь инкубируют в темноте в течение сутокпри комнатной температуре и добавляютпо каплям к раствору 15 мг человеческогосывороточного альбумина в 5 мл фосфатногобуфера Рн 7,4. Смесь перемешивают в течение суток при комнатной температуре и разделяют на колонке с сефадексом 6-25.Полченный конъюгированный антиген бензпиренчеловеческий сывороточный альбумин содержит 5 - 6 моль бензпирена на моль белка.Пример 3. Получение конъюгированногоантигена 3-метилхолантрен - бычий сывороточный альбумин.405 мг (1,9 10М) метилхолантрена растворяют в 0,5 мл сухого диоксана, добавляют3 мг (1,910М) м-хлорнадбензойной кислоты, инкубируют смесь в темноте при комнатной температуре в течение 24 ч, Полученное реакционноспособное производное метил 45холантрена вводят в реакцию с 15 мг бычьего сывороточного альбумина в 5 мл фосфатного буфера. После очистки гель-фильтрацией на сефадексе бполучают конъюгированный антиген метилхолантрен-бычий 50сывороточный альбумин, в котором с одноймолекулой белка ковалентно связаны 5 молекул метилхолантрена,Пример 4. Получение конъюгированногоантигена 3-метилхолантрен - бычий сыворотсцный альбумин. 55 15 мг (5,7 10 з М) метилхолантрена в 0,5 мл сухого лиоксана инкубируют с 18 мг (11,4 10 М) м-хлорнадбензойной кислоты в течение суток при комнатной температуре и добавляют по каплям к растрору 15 мг фосфатного буфера рН 7,4. После инкубации в течение суток при комнатной температуре получают конъюгированный антиген метилхолантрен - бычий сывороточный альбумин, в котором с одной молекулой белка ковалентно связаны 17 молекул метилхолантрена.Пример 5. Получение конъюгированного антигена 3-метилхолантрен - человеческий сывороточный альбумин.5 мг (31,9 10 5 М) метилхолантрена в 0,5 мл сухого диоксана инкубируют с б мг (3,8 10 М) м-хлорнадбензойной кислоты в течение суток при комнатной температуре и добавляют по каплям к раствору 15 мг человеческого сывороточного альбумина в 5 мл фосфатного буфера рН 7,4, После инкубации в течение суток при комнатной температуре получают конъюгированный ан-. тиген метилхолантрен-человеческий сывороточнь 1 й альбумин, содержащий 9 молекул метилхолантрена на моль белка.Пример б. Получение конъюгированного антигена метилхолантрен-бычий сывороточный альбумин.5 мг (31,9 10 М) метилхолантрена в 0,5 мл сухого диоксана инкубируют с 20 мг (4,2 10М) мононадфталевой кислоты в течение суток при комнатной температуре и добавляют по каплям к раствору 5 мг бычьего сывороточного альбумина в 5 мл фосфатного буфера рН 7,4. После инкубацйи в те. чение суток получают конъюгированный антиген метилхолантрен.бычий сывороточный альбумин, содержащий 4 моль метилхолантрена на 1 моль белка. Таким образом, в предлагаемом способе реакционноспособное производное углеводородов получают в одну стадию, в то время как в известном в три стадии; исключается целый ряд реагентов и растворителей (концентрированные азотная, соляная, уксусная кислоты, хлорид олова, концентрированный раствор аммиака, бензол, толуол, лигроин), в том числе опасный для жизни реагент - фосген; процесс значительно убыстряется, в предлагаемом способе он требует 3 дня, в то время как в известном 10 дней. Значительно сокращены расход материалов и затраты труда на единицу продукции, за счет чего достигается существенное удешевление и упрощение технологии.Кроме того, предлагаемый, способ обла. дает преимуществом получения соединений, состав и структура которых максимальна приближена к естественным (природным) конъюгированным антигенам,