Способ индикации нитевидного вируса пчел

СОЮЗ СОВЕТСНИХООЩЦИРНЕСНИКРЕСПУЬЛ 4 Н 12 Н 7/ ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ВИДЕТЕЛЬСТВУ(2 ГробовховЛенинститарии ауч кс(53) 576.858(088 (56) 1. ВаЯ.Реу Ь и Иооов й.0. Рго вепсоцв Шгцв оГ Ч 3.гоРодуф, 1981, р.1-2 .(прототип) 6.М.Ыае. Сагреп 1 ег егг 1 ев оХ" а Юе Ьопеу Ь ч. 114, Р 1 1) 3445496/30(54) 57) СПОСОБ ИНДИКАЦИИ НИТЕВИДНО-ГО ВИРУСА ПЧЕЛ, включающий постановку реакции двойной иммунодиффузни в агаре испытуемого антигена с иммунной сывороткой, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения эфФективности способа, в качестве иммунной сыворотки используют кроличью гипериммунную сыво,ротку, полученную с помощью штамма Ар 1 в ЕИ ааеп 1 оцв ч 1 гцв В 31.40 55 Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности кразработке способа индикации нитевидного вируса пчел (НВП)НВП вызывает заболевание медоносных пчел, сопровождающееся потерей .5способности к полету, параличомконечностей, наличием гемолимфы молочно-белого цвета, разрушениемклеток гемолимфы в пчелиной семьенаблюдают постоянную небольшую гибель пчел, либо семья погибает. В сов"реМенных условиях развития крупныхпчеловодческих и матковыводных совхозов НВП может навести большой экономический ущерб народному хозяйствуМорфологические признаки. Частицы НВП эллипсоидной формы, размером400100 нм или 450 150 нм, состоятиэ нуклеокапсида, размером 3000 60или ЗООО 40 нм, заключенного воболочку.Физико-химические свойства.Нуклеокапсид содержит двухнитевуюДНК с молекулярным весом приблизительно 12 10 6 дальтонов, плавучиеплотности в хлористом цезии целойчастицы, нуклеокапсида и ДНК - равнысоответственно 1,28; 1,36 и 1,71 г/см",Частице НВП содержит примерно 12белков с молекулярными весами от13 до 70 кД, которые приблизительноравномерно распределены между обо-,лочкой и нуклеокапсидом.Биологические свойства. НВП поражает только медоносных пчел; рабочих особей и маток. Он обнаруженв следующих органах пораженныхособей: мозге, вентральном нервномтяже, глоточных, верхнечелюстныхи восковых железах, жировом теле,большой ядовитой железе и резервуаре этой железы, средней кишке, яични".ках и гемолимфе. Репродукция вирусаотмечена лишь в жировом теле и яичниках. В инфицированных, клетках 45жирового тела и яичниках отмеченоразрушение ядерных оболочек. Экспериментальная инфекция была вызванау взрослых рабочих пчел при скармливании или иньекции выруссодержащихпрепаратов, Не удалось заражениепчелиных личинок 1-го возраста, мышат-сосунов, 21-дневных мышей, тараканов и личинок большой восковоймоли. НВП широко распространен вСША, Англии, обнаружен в Японии,Новой Зеландии и Италии,НВП был обнаружен с помощьюэлектронно-микроскопического исследования экстрактов из мертвыхпчел или геьюлимфы из живых пчел 11 З60Недостатком известного способаиндикации является то, что электронный микроскоп является уникальной дорогостоящей аппаратурой и недоступен практическим лабораториям. 65 Цель изобретения - повышение эффективности способа индикации нитевидного вируса пчел.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу индикации нитевидного вируса пчел, включающему постановку реакции двойной иммунодиффузии в агаре испытуемого антигена с иммунной сывороткой, в качестве иммунной сыворотки используют кроличью гипериммунную сыворотку, полученную с помощью штамма Ар 1 в Й 11 авеп 1 ацз 91 гцз В 31.Для получения кроличьей гипериммунной сыворотки в качестве антиге" на используют вирионы НВП штамма 9 31, Пчел в количестве 100-150 штук, зараженных данным штаммом и погибших от НВП, механически гомогенизируют общепринятым методом с добавлением 0,01-0,03 М Фосфатного буфера рН 7,0-7,2 (1 мл на пчелу). Гомогенат осветляют при 1800-2000 д 8-10 мин, супернатант центриФугируют при 8000-10000 ц 20-25 мин. Осадок суспендируют в 2-3 мл 0,01- 0,03 М фосфатного буфера рН 7,0-7,2 и концентрированную вируссодержащую суспенэию центрифугируют в градиенте плотности сахарозы от 20 до 60 в течение 3-3,5 ч при 30000- 32000 ц. Собирают Фракцию, содержащую вирус, при помощи подходящего шприца с иглой, доводят ее до объема 3-4,5 мл Физиологическим раствором, делят на три,равные части, разливают во Флаконы и замораживают.Гипериммунизация кроликов, Перед первой инъекцией одну часть полученного антигена раэмораживают, смешивают с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 и вводят кролику в подушечки задних лапок по 0,2-.0,3 мл, в бедренные мьаацы по 0,5- 0,75 мл и внутрикожно в три точки спины по 0,2-0,3 мл. Вторую инъекцию делают через 21 день, при этом одну часть аитигена размораживают, доводят Физиологическим раствором дообъема 2-3 мл и вводят кролику внутривенно, Третью инъекциюделают внутривенно аналогичным образом через 7 дней после второй. Обескровливание кроликов проводят на 7-10 день после третьей инъекции, кровь собирают в стерильную колбу, выдерживают при 37 ОС до образования сгустка, отделяют от стенок стерильной стеклянной палочкой и оставляют при 4 С на ночь. На следующий день сыворотку отсасывают, консервируют мертиолятом в соотношении 1:5000"1:10000 и запаивают в ампулы.Исследуемых пчел в количестве 8-12 штук гомогениэируют механически с добавлением 8-12 мл дистиллированной воды. Гомогенат оставляют1068475 Составитель С.СветлышевРедактор Г.Волкова Техред И,Метелева . Корректор Л.Патай Заказ 11397/22 Тираж 525 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, %-35, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП фПатентф, г, ужгород, ул. Проектная, 4 при 1000-,2000 д в течение 8-10 мин, супернатант центрифугируют при 8000-10000 д в течение 20-25 мин, . Образовавшийся осадок суспендируют в 0,1-0,2 мл дистиллированной воды и используют в качестве в .нтигена. 5 Одновременно аналогичным образом готовят контрольный положительный антиген из пчел, погибших от НВП штамма 9 31. Используют агарДифкоф, В качестве растворите ля для приготовления 0,9-1-ного раствора геля применяют 0,1-0,2 М боратный буфер (рН 8,4-8,5) с добавлением 5-8 г хлористого натрия на 1 л раствора. Реакцию ставят в чашках Петри или на предметном стекле. Учет реакции проводят по формированию полос прецинитации,Данный способ может быть представлен в двух вариантах: макрометодом по Оцсп 1 егФоп 1 (1948) и микро- методом по Мапз 1 (1958)..Макрометод. В чашке Петри или на предметном стекле получают слой агарового геля толщиной 1,5-2 ма, вырезают лунки диаметром 5-7 мм(расстояние между лунками 3-6 мм). Лунки заполняют антисывороткой и антигенами до краев, инкубируют во влажной камере при комнатной температуре. Учет реакции проводят 30 через 24-36 ч по Формированию полос преципитации.Микрометод. В чашке Петри или на предметном стекле получают слой агарового геля толщиной 0,8-1,5 мк 35 (расстояние между лунками 1,4- 1,6 мм)Лунки заполняют антисывороткой и антигенами до краев, инкубируют во влажной камере при 35- 37 фС. Учет реакции проводят через 40 3-.6 ч по формированию полос преципитации. Использование микрометода реакции двойной иммунодиффузии снижает расход реагентов, сокращает время получения результатов реакции.Приготовление антигена для реакции. Восемь исследуемых пчел гомогенизируют механически с добавлением 8 мл дистиллированной воды. Гомогенат осветляют при 1000 д в течение 8 мин, супернатант центрифугируют при 8000 д 20 минОбразовавшийся осадок суспендируют в 0,1 мл дистиллированной воды и используют в качестве антигена. В макро- или микрометоде реакции двойной иммунодиффуэии с гомологичной,антисывороткой полученный антиген образует 1-2 полосы преципитации10 исследуемых пчел гомогениэируют механически с добавлением 10 мл дистиллированной воды. Гомогенат осветпяют при 1500 д в течение 9 мин, супернатант центрифугируют при 9000 д в течение 22,5 мин. Образовавшийся осадок суспендируют в 0,15 мл дистиллированной воды и используют в качестве антигена. В макро- или микро- методе реакции двойной иммунодиффуэин с гомологичной антисывороткой полученный антиген образует 1-2 полосы преципитации.12 исследуемых пчел гомогенизи-. руют механически с добавлением 12 мл дистиллированной воды. Гомогенат осэетляют при 2000 д в течение 10 .мин, супернатант центриФугируют при 10000 д в течение 25 мин. Образовавшийся осадок суспендируют в 0,2 мп дистиллированной воды и используют в качестве антигена. В макро- или микро- методе реакции двойной иммунодифФузии с гомологичной антисывороткой полученный антиген образует 1-2 полосы преципитации.Предложенный способ апробирован нами с положительным результатом в лабораторных условиях.Предложенный способ является простым, доступным и достоверным. Применение его в ветеринарной практике позволит своевременно выявлять данный вирус. Способ найдет применение в научно-исследовательских институтах, областях и районных ветбаклабораториях.