Способ определения активности моноаминоксидазы в тромбоцитах

(71) В Красно тельск ,психиа .(53) 6 есоюзный орден о Знамени науч й институт общ рии им, В.П.Се 6.89(088.8)( 5 6 Спе дел в т мед ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТХРЫТ ВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ) 1. Веревкина И,В., Курилова Иктрофотометрический способ опреения активности моноаминоксидазыромбоцитах человека. фВопросыицинской химиифф. 1978, 9 1,с. 137-140.2. Ба 1 йвиК К., Яада 1 Н ОМвиЬо К., Ейо 8., КоЬовЫ К,у ОЫсцта уь А Вепв 1 й 1 че Г 1 цойовеМ 1 с аввау оЕ Нявап Р 1 афе 1 е 1 Мопоав 1 пе Охране аЫ 1 Св Орр 11 саМоп оп Во АввеаввепфоЮ Мопоав 5.пе Ох 1 йаве Тпп 1 Ь 1 Вот. - Сйев. Р 1 ахв. Ви 11, 26(11), 3471-34 Я 6, 1978.(54) (57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МОНОАМИНОКСИРАЗЫ В ТРОМБОЦИТАХ путем инкубирования исследуемого фермента с субстратом в присутствии индикатора с последующим измерением его флуоресценции, о т л и ч а ю " щ н й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа при.диф ференциальнойдиагностике психопатологических состояний, выделяют митохондриальные мембраны тромбоцитов, далее добавляют 110 -2 10 М перокси" дазы и инкубацию проводят при 36- 38 С в течение 1520 мин, затем в реакционную смесь одновременно вносят субстрат моноаминоксидазы и скополитин повторно инкубируют. при 36 - 38 С в течение 20 - 50 мин и измеряют величину флуоресценции скополитина до и после инкубации,.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю" щ и й с я тем, что, в качестве субстратов моноаминоксндазы используют фенилэтиламин, бензиламнн или триотамин,Изобретение относится к медицине,в частности к ферментному анализукрови человека, и может быть использовано в медицинской практике приизучении биохимических показателейкрови в клинике и эксперименте,5Известен способ определения активности моноаминоксидазы н тромбоцитах человека, основанный на способности алкогольдегидрогеназы изтканей млекопитающих катализиронать 10восстановление альдегидон, образующихся при окислительном деэаминировании аминов до соответствующих спиртов в присутствии НАДН 1)Недостатком способа является его 15низкая чувствительность.Известен также способ определенияактивности моноаминоксидазы путеминкубирования исследуемого ферментаа субстратомдобанлением индикатора 20с последующим измерением его Флуоресценции 2).Однако известный способ имеетнизкую информативную ценность, таккак в качестве субстрата можноиспользовать только, бензиламин, н товремя как по современным предстанле 1ниям необходимО исследовать актив"ность моноаминоксидазы с несколькимисубстратами, особенно в условиях патологии. Кроме того, 1,2-диаминонаф 5тален, используемый н качестве инди"катора в известном способе, являетсясильно действующим канцерогенным веществом.Целью изобретения является повыше ние чунствительности способа при диф"ференциальной диагностике психопатологических состояний.Постанленная цель достигается тем,что согласно способу определения активности моноаминоксидазы н тромбоцитах путем инкубиронания исследуемого Фермента с субстратом в присутствии индикатора с последующим измерением его Флуоресценции, выделяют 45митохондриальные мембраны тромбоцитов далее добавляют 1 10 -2 10 Мпероасидазы и инкубацию проводят при36"38 С в течение 15 " 20 мин, затемОв реакционную смесь одновременно вно. 50сят субстрат моноаминоксидазы и ско"политин повторно инкубируют при36 - 38 С в течение 20 - 50 мин и измеряют величину флуоресценции скопо"литина до и после инкубации,Кроме того, н качестве субстратовмоноаминоксидазы используют фенил"этиламин бензиламин или триптамин.Способ осуществляют следующим об" разом. 60Иэ крови испытуемого выделяют тромбоциты, из которых получают мото" хондриальные мембраны, Реакционную смесь, содержащую исследуемые фрагменты митохондриальных мембран (О,О 65 0,2 мю белка), пероксидаэу из хрена(1 10 7-2 10 М), калий-натрий фосфат-,ный буфер 0,2 М с рН 8,4 до конечно"го объема 1 мл, инкубируют в течение15 - 20 мин при 36 - 38 оС с качаниемв аппарате Варбурга для удаления эндогенных субстратов пероксидаэы. После охлаждения проб для определенияактивности моноаминоксидазы к реакционной смеси одновременно добавляютсубстрат фермента: фенилэтиламин,бенэиламин или триптамин, в насыщающих концентрациях и скополитин споследующим измерением величины флуоресценции скополитина. Далее пробыинкубируют н течение 20 - 50 минпри 36 - 38 С. Реакцию останавливаютопомещением проб н ледяную баню и определяют величину тушения флуоресценции скополитина.Удельную активность моноаминоксидазы выражают н нмоль Н 20, образонаншейся в ходе окислительного деза"минирования аминов на 1 мг белка за20 - 50 мин повторного инкубированияи описанных услониях.П р и м е р 1, Суспенэию фрагментон митохондриальных мембран тромбоцитон 0,01 мг н объеме 0,5 мл натрий"калий Фосфатного буфера рН 8,4 поме"шают н 0,35 мл этого же буфера, со"держащего 10 М пероксидазы иэ хренаи инкубируют 15 мин при 36 С с качаниями н аппарате Варбурга, После охлаждения н ледяной бане в реакцион-ную.смесь одновременно добавляют .скополитин н концентрации 17 нмоль на1 мл и бенэилааин 2,510 М, после чего пробы инкубируют 50 мин при 36 Св аппарате Варбурга. После охлаждения проб измеряют величину тушенияФлуоресценции скополитина при длиневолны 460 нм, при длине волны возбуждения 350 нм и наблюдают генерацию32 нмоль НО на 1 мг белка,П р и м е р 2. Реакционную смесь,содержащую фрагменты митохондриальных мембран тромбоцитон 0,05 мг вобъеме 0,5 мл натрий-калий Фосфатно"го буфера рН 8,4, пероксидазы 210 Мв 0,35 мл этого же буфера, инкубируют 20 мин при 38 С н аппарате Варбурога, После охлаждения реакционной смеси и нее одновременно добавляют скополитин в концентрации 17 нмоль на1 мл пробы и фенилэтиламин 104 М, после чего пробы повторно инкубируютв течение 20 мин при 38 С, охлаждают,измеряют величину тушения флуоресценции скополитина и наблюдают генерацию13,1 нмоль Н 10 на 1 мг белка. П р и м е р 3. Суспензию Фрагментов митохондриальных мембран тромбоцитон 0,02 мг н объеме 0,5 мл натрий" калий Фосфатного буфера рН 8,4 поме" щают в 0,35 мл эого же буфера, содержащего 2 10 М пероксидаэы, инкуЗаказ 8407/41Тираж 873 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета. СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 .Филиал ППП Патент , г.ужгород, ул.Проектная, 4 бируют 15 мин при 37 ОС. Далее в ох,лажденную реакционную смесь добавляют скополити 17 нмоль на .1 мли триптамин 10 М и измеряют величину флуоресценции скополитина. Затем реакционную смесь повторно инкубируют, - 5 40 мин при 37 С, охлаждают и измеря".оют флуоресценцию скополитина и по изменению флуоресценции определяют активность моноаминоксидазы. При этих условиях наблюдают генерацию 27,9 нмоль НО на 1 кг белка.Предлагаемый способ нетоксичен, обладает высокой чувствительностью, может быть использован в психиатрии при диагностике различных психических заболеваний и оценке зффектив" ности лечения.