Способ диагностики деструкции ткани мочевыводящей системы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК з(59 А 61 В 10 ОАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ/ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИ(71) Тюменский государственный медицинский институт(54) (57) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДЕСТРУКЦИИ ТКАНИ МОЧЕВЫВОДЯЩЕЙ БО 118352 СИСТЕМЫ путем исследования мочи, отличаощийся тем, что, с целью установления деструкции в кортикальном слое почечной ткани, определяют содержание лизофосфатидилхолина и гидроперекисей липидов, активность трансамидиназы и щелочной фосфатазы, и при появлении в моче лизофосфатидилхолина и трансамидиназы, активности щелочной фосфатазы от 1,5 до 37,5 нмоль/ /мл/мин и содержании гидроперекисей липидов от 1,08 до 4,86 нмоль/сут диагностируют деструкции почечной ткани в кортикальном слое.Изобретение относится к медицине, аименно к педиатрии, в частности к способамдиагностики деструкции тканей мочевыводящих путей у детей.Известен способ диагностики деструкции ткани мочевыводящей системы путем исследования мочи.Указанный способ диагностики основан на определении активности эндогенных фосфолипаз А и С в сыворотке крови и моче при помощи реакции экстрактов с яично-агарозной пластинкой с образованием различных классов фосфолипидов. В норме (у здоровых детей) активность фосфолипазы С не обнаруживается, имеется незначительная активность фосфолипазы А. Повыщение актив ности фосфолипазы С в моче позволяет диагностировать активный деструктивный процесс в мочевыводящих путях.Способ является безопасным для больных, позволяет диагностировать мембранодеструктивный процесс в мочевыводящих путях, что является важным для уточнения характера заболевания 1.Однако, выявляя активный деструктивный процесс в тканях мочевыводящих путей, способ не позволяет уточнить локализацию 25 воспалительно-деструктивного процесса в мочевыводящем тракте (гломерулярный или тубулярный отдел нефрона, чашечно-лоханочная система, мочевой пузырь). Способ не позволяет также установить механизмы (причины) развития деструктивного процесса в тканях мочевыводящих путей, что затрудняет выбор наиболее рационального метода терапевтического воздействия.При значительном бактериальном загрязнении мочи, что наблюдается при некоторых заболеваниях мочевыводящего тракта, трудно исключить присутствие экзогенной (бактериальной) фосфолипазы А и С в моче, чтоможет приводить к ошибкам в диагностикедеструктивного процесса.Цель изобретения - установление деструкции в кортикальном слое почечной ткани.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу диагностики деструкции ткани мочевыводящей системы путем исследования мочи определяют содержание лизофосфатидилхолина и гидроперекисей лилидов, активность трансамидиназы и щелочной фосфатазы, и при появлении в моче лизофосфатидилхолина и трансамидиназы, активности щелочной фосфатазы от 1,5 до 37,5 нмоль/мл/мин и содержании гидроперекисей липидов от 1,08 до 4,86 нмоль/сут диагностируют деструкцию в почечной ткани в кортикальном слое.Способ осуществляют следующим образом.Мочу, взятую из суточного количества, центрифугируют для удаления клеток мочеЗО 3540 4550 55вого осадка при 3000 об/мин 15 мин. Содержание лизофосфатидилхолина в моче определяют методом тонкослойной хроматографии на силикагеле. Липиды экстрагируются из 20 мл мочи смесью хлороформ - метанол. Затем 0,2 мл экстракта подвергают восходящей хроматографии в системе растворителей: хлороформ в метанол в аммиак в (в соотношении 30:8,8:1,0:0,4). После хроматографии пластины проявляют в парах йода, Пятно лизофосфатидилхолина элюируют и пробирку помещают на песочную баню для перевода органического фосфора в неорганический. Содержание фосфора в пробе определяют по реакции с малахитовым зеленыМ путем фотометрии комплекса при длине волны 650 нм.Расчет содержания лизофосфатидилхолина в моче проводят по формуле:Х= аХ 0,016 ХО, где Х - содержание лизофосфатидилхолинав моче в мкмоль/сут; - содержание фосфора в пробе, найденное по калибровочному графику; 0,016 - коэффициент пересчета в мкмоль; 3 - суточный диурез в мл.Определение активности щелочной фосфатазы в моче производят оптимизированным методом.Определение активности трансамидиназы проводят следующим образом. К 1 мл буферного раствора с субстратом (0,1 М фосфатный буфер с рН 7,4, содержащий 17 10М Л-аргинина и 0,14 М глицина) добавляют 0,5 мл мочи. Смесь инкубируют 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 1 мл раствора нингидрина (2,5%-вый раствор нингидрина в метилцеллюлозе) и 3 мл, ледяной уксусной кислоты. Смесь инкубируют 60 мин в кипящей водяной бане. Охлаждают при комнатной температуре и определяют оптическую плотность раствора при длине волны 546 нм.Расчет активности фермента производят . по формуле:Х -где Х - активность трансамидиназы внмол ь/мл/мин;Еол - экстинция опыта;экстинция контроля;конечный объем реакционнойсмеси в мл;18 10- коэффициент молярной экстинции раствора орнитина внмоль/см ;120 - время инкубации в мин;0,5 - объем мочи.Содержание гидроперекисей липидов в моче определяют методом амперометрического титрования.Липиды экстрагируют из 20 мл мочи смесью хлороформ - метанол. Липидный экст118352 Лизофосфатидилхолин, мкмоль/сут.Щелочная фосфатаза, нмоль/мл/мин Не определяется1,2+0,29Не определяется0,39+0,0 Трансамидиназа, нмоль/мл/,инГидроперекись липидов, нмоль/сут ракт инкубируется с 50 мг йодистого калия в темнотеч. Выделившийся под влиянием перекисей липидов свободный йод связывают добавлением 1 мл 0.0001 н р;.створа тиосульфата натрия, избыток которого оттитровывают амперометрически 0,0001 н раствором йодноватокислого калия в ячейке поля рографа.Расчет содержания гидроперекисей липидов производят по формуле Х = 4,055 Х А х 0 Х 10 ,Биохимические показатели мочи у здоровых лиц (Х + м) и = 20,У здоровых лиц отмечается лишь незначительная активность щелочной фосфатазыв моче и очень низкий уровень экскреции перекисей липидов с мочой. При появлении вмоче лизофосфатидилхолина, повышении активности щелочной фосфатазы выше1,5 нмоль/мл/мин, появлении трансамидиназной активности мочи и увеличении экскреции с мочой гидроперекисей липидов выше1,0 нмоль/сут диагностируют активный деструктивный процесс.в почках, преимущественно в проксимальном отделе нефрона, обусловленный активацией процессов свободнорадикального окисления липидов почечныхцитомембран.Пример 1. Больной П., 14 лет. Поступилв клинику с жалобами на отеки, слабость,изменения в анализах мочи (протеинурия до2 в . 4%). Болен в течение 10 лет, обостренияпочечного процесса 2 - 3 раза в году. В кли 40нической картине заболевания доминируетвыраженный отечный синдром, значительнаяпротеинурия. Учитывая длительность заболевания, отсутствие эффекта от проводимойтерапии, с целью диагностики развития деструктивного процесса в почках проведеныспециальные биохимические исследованиямочи: содержание лизофосфатидилхолинав моче 0,74 мкмоль/сут, активность щелочной фосфатазы 6,90 нмоль/мл/мин, трансамидиназы 2,77 нмоль/мл/мин, содержащие гидроперекисей липидов в моче - 1,82 нмоль/сутНа основании клинической картины заболевания и результатов биохимических исследований мочи диагностирован активный деструктивныЙ прОцесс (повышена экскреция с мочей лизофосфатидилхолина), преимущественно в проксимальном отделе нефрона (высокая активность щелочной фосфатагде Х - содержание гидроперекисей липидов в моче в нмоль/сут;Ь разница (мл) раствора йодноватокислого калия, пошедшего на титрование контроля и опыта;4,055 - расчетный коэффициент для пересчета в нмольР - суточный диурез в мл.Контрольные (нормативные) показатели содержания продуктов перекисного окисления, мембранолиза и ферментативной активности мочи следующие: зы, трансамидиназы) в результате активизации процессов свободно-радикального окисления липидов (повышена экскреция с мочой гидроперекисей липидов) Проведенное в последующем прижизненное морфологическое исследование почечной ткани обнаружило и подтвердило изменения в гломерулярном и тубулярном отделе нефрона, с преимущественным поражением эпителиальных клеток проксимального канальца в виде дегенеративно-деструктивных изменений, что свидетельствует о достоверности полученных данных.Пример 2. Больная М. 12 лет. Больна в течение 3 лет. В клинике доминирует незначительный отечный синдром, умеренная протеинурия (до 2 г/сут), незначительная гематурия. Обострения процесса 1 раз в год. С целью диагностики возможного деструктивного процесса в почках проведены специальные биохимические исследования мочи. Получены следующие результаты: содержание лизофосфатидилхолина 1,30 мкмоль/сут, активность щелочной фосфатазы 37,5 нмоль/ /мл/мин, трансамидиназы -6,75 нмоль/мл/ /мин, . экскреция гидроперекисей липидов 4,86 нмоль/сут. В результате проведенных исследований диагностирован активный деструктивный процесс (значительно увеличена экскреция с мочой лизофосфатидилхолина), преимущественно в проксимальном отделе нефрона (высокая активноСть щелочной фосфатазы, трансамидийазы) в результате активизации процессов свободно-радикального окисления липидов (значительно повышена экскреция с мочой гидроперекисей липидов). Проведенное в последующем прижизненное морфологическое исследование почечной ткани обнаружило мембранозный тип гломерулонефрита с изменением базальных мембран капилляров клубочка, с признака1118352 Составитель Б. 11 угаьев Редактор Л. Авраменко Тсхрсд И. Верес Корректор А. Зимокосов Заказ 7311/3 Тираж 687 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4ми дистрофии эпителия проксимального отдела нефрона (деструкции кортикального лоя почки). Таким образом, клинические примеры и результаты морфологического исследования почечной ткани свидетельствуют о том, что использование предлагаемого способа диагностики деструктивного процесса в почечной ткани позволяет с высокой степенью досто. верности диагностировать деструкцию почечной ткани в кортикальном слое, даже при незначительных клинических проявлениях заболевания определить локализацию и выяснить механизмы деструкции. Выяснение локализации деструктивного процесса и механизмов деструкции необходимо для уточнения характера патологического процесса в почках, что расширяет диагностические возможности способа и является основанием для проведения целенаправленных терапевтических мероприятий с использованием препаратов с антиоксидантным и мембранопротекторным фармакологическим эффектом.