Способ получения корпускулярного антигена

СОЮЗ СОВЕТСКИХШМЮПЮЪЧеп(иРЕСПУБЛИК 61 К 39 002 тФчзсь сФвюа 2 ф ОПИ Н АВТО ИЕ ИЗ Я ЕТ ОМУ СОЙДЕТ Т го Знамезитологии ,И,МарциГОСУДАРСТОЕННЫЙ КОМИТЕТ СПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКР(72) Т,В. Продеус, М.М. Соловьеви Л,М. Гордеева71) Ордена Трудового Краснони институт медицинской параи тропической медицины им. Еновского(56) 1. М. Со 1 даап "Еча 1 ца 11 оп оГа Г 1 цогезсепг. апйЮоду йезС Еогащ Ь 1 аз 1 з из 1 пд гъо и 1 де 1 у д 1 КЕег 1 пдащеЬа згга 1 пз аэ аи 11 реп, Лвег,Тгор. Мед. Бур, 1966, У 15, р.694700.2, Соловьев М,И Пшеничный Г,С.Изучение сывороток от больных амебиазом кишечника реакцией флюоресцирующих антител. фМедицинскар паразитологияс, 1971, М б с. 643-647.(прототип),(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРПУСКУЛЯРНОГО АНТИГЕНА из поликсенической культуры дизентерийной амебы путем их выращивания на питательной среде, содержащей сопутствующую бактериальную флору, с последующей очисткой и инактивацией амеб, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта ,ва .7-14 час .до посева амеб в питательную среду вносят 0,01-0,04 мл надосадочной жидкости 48-72-часовых культур дизентерийной амебы, содержащей сопутствующую бактериальную флору,и после выращивания проводят очистку амебной взвеси центрифугированием в 8-ном растворе сахарозы при 1700- Ц 1800 об/мин в течение 30-35 с, 1009471Изобретение относится к областимедицины, преимущественно к разделуполучения реагентов и препаратов длядиагностики паразитарных болезнейчеловека, в частносТи амебиаза.Известен способ получения корпускулярного антигена из поликсеническойкультуры дизентерийной амебы, заклю, чающийся в выращивании амеб и очистке их от неспецифических компонентовсреды 1 . 1 ОИзвестен способ получения корпус"кулярного антигена иэ поликсеническойкультуры дизентерийной амебы путемее выращивания на питательной среде,содержащей сопутствующую бактериальную флору, с последующей очисткойи инактивацией амеб 21 .Однако известные способы приготовления антигена не обеспечиваютвысокого выхода целевого продукта,Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта,Цель достигается тем, что в способе получения корпускулярного антиФгена из поликсенической культурыдизентерийной амебы, предусматриваю-,щем выращивание их на питательнойсреде, содержащей сопутствующую бактериальную флору; с последующей очисткой и инактивацией амеб, за 714 ч до посева амеб в питательнуюсреду вносят 0,01-0,04 мл надосадочной жидкости 48-72-часовых культурди,.ентерийной амебы, содержащей сопутствующую бактериальную флору, ипосле выращивания амеб проводят очистку амебной взвеси центрифугированием в 8-ном растворе сахарозы при1700-1800 об/мин в течение 30-35 сСпособ иллюстрируется следующимипримерами, 40П р и м е р 1, Наращивание амебв бактериальных пробирках.В стерильныее пробирки, заполненные на 2/3 средой Павловой (10-12 мл)беэ крахмала, добавляют 0,01-0,04 мл 45надосадочной жидкости из 48.-72-часовых культур дизентерийной амебы.Пробирки, закрытые стерильными пробками, помещают в термостат (Зб,6 ОС),Через 7-14 ч на прекондиционированнуюсреду производят посев амеб из 4872-часовых культур. Пробирки инкубируют в горизонтальном положении при36,6 ОС. Через 24-28 ч амеб снимаютсо стенок пробирки и осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин, При посеве 50;100 тысамебна пробирку с прекондиционированнойсредой через сутки наблюдается увеличение численности амеб примерно в5 раз. 60П р и м е р 2, Наращивание амебво флаконах для культуры тканей емкостью 100 мл,Стерильный флакон заполняют на2/3 средой Павловой (80 мл) без крахмала, вносят 0,07-0,3 мп надосадочйой жидкости иэ культуры дизентерийной амебы. Флакон, закрытый резиновой пробкой, помещают в термостат(Зб,боС)Через 7-14 ч вносят взвесь амебиз 2-3 пробирок с 48-96-часовой культурой, из которых предварительно удален крахмал и большая часть среды. Флакон в горизонтальном положении помещают в термастат (36,6 С).Через сутки (24-28 ч) рост амеб можно оценить визуально по всей горизонтальной поверхности флакона при малом увеличении микроскопа, После осторожного удаления более половины культуральной жидкости амеб снимают со стенок, флакона с помощью стеклянного шпателя или многократным пипетированием культуральной жидкостй, или легким покачиванием, Затем взвесь амеб центрифугируют 5 мин при1500 об/мин. При посеве 60-150 тыс.амеб наблюдается увеличение численности амеб в 8-12 раз.П р и м е р 3, Освобождение полученной взвеси амеб от неспецифических комгонентов среды.Взвесь амеб из культуры в объеме1-1,5 мл осторожно наслаивают на 5-6 мл сахароэы. Это приводит к самопроизвольному осаждению наиболее крупных частиц и зерен крахмала на дно пробирки, Амебы остаются в верхней части содержимого пробирки. Более деликатная и тщательная очистка отмикробного компонента среды достигается центрифугированием. Для этого2-3 мл верхней части содержимогопробирки наслаивают на столб сахарозы высотой 5 см,и центрифугируютв течение 30 с при 1700-1800 об/мий.Микробные частицы, бактериальныепленки оседают на внутренней поверхности пробирки, поэтому осторожно, не касаясь стенок, содержимое с помощью пастеровской пипетки переносят в другую пробирку. Амеб концентрируют при 1500 об/мин в течение 3-5. мин.Фиксацию амеб проводят эабуференным 10-ным формалином и отмывают полученную взвесь, Отмытый осадок суспендируют в забуференном физиологическом растворе (0,015 М и фосфатный буфер - 7,2) из расчета получения в капле взвеси от 20 до 40 амеб прималом увеличении микроскопа. Взвесь амеб переносят на размеченные предметные стекла с кружками диаметромдо 8 мм. После естественного высыхания (2-3 ч) фиксированная на предметных.стеклах взвесь интактных,отмытых в сахарозе, свободно лежащихамеб служит антигеном для постановки реакции.Предлагаемый .способ позволяетповысить выход амеб (через 24 ч куль1009471 Составитель П. БонарцевТехред А.Бабинец Корректор А. Ференц Редактор О, Юркова Заказ 2539/4 Тираж 711 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул, Проектная 4 тивирования количество амеб в 1 млсреды 250000-300000, тогда как в известном способе через 48 ч культивирования количество амеб 50000-70000).Кроме того, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет снизить необходимость в приготовленииантигена до 9-10 раэ в год, так какантиген можно готовить через 6-7 недель, вместо 2-3 недель по известному.