Способ получения полисахаридов

(71) Куреха Кагаку ККайся (Л.)(57) Изо высокомо конкретн на основ ПОЛИ САХАРИДО сится к химии лисахаридов, полисахаридо Согдо 1 цз, об ОБ ПОЛУЧЕНретение отекулярныхк полученгрибов ро ОСУДАРСТВЕННЦЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ладающих высокой противоопухолевой активностью при пероральном применении, и может быть использовано при производстве лекарственных средствИзобретение позволяет расширить арсенал биологически активных средств за счет того, что мицелий грибов рода Сог 1 о 1 из экстрагируют 0,1-0,4 н, водным раствором едкого натра при 93-97 С, полученный экстракт подвергают ультрафильтрации при давленииг0,5-5,0 кг/см или обратному осмосу при давлении 20-35 кг/см , затем вводят 84-90 об.Е сульфата аммония и полученный осадок растворяют в во- де до образования 3-107-ного раствора с последующей его очисткой сначала ультрафильтрацией при давлении 0,5-5,0 кг/см и затем в ионообменной диэтиламиноэтилцеллюлозной колонке концентрированием: раствора и сушкой целевого продукта, 3 табл.17 18 1403990 Т а б л и ц а 2-1 Стадия высаливания Опыт Стадия обратного осмо"са адия растрения Коли-. честКоличествопорциираствора,еение,й кг/см-3" 2-4 35 280 Условия проведения процесса, параметры процесса и некоторыерезультаты, полученные при проведении стадии обратногоосмоса дпя очистки водного экстракта штамма СМ Согдо 1 цз чегвсо 1 ог (Гг) Яое 1 Количество (НН )добавляемог к порции, г/мл (мас.7/об) 0 50 (порция 1.) 45/50 (90) 50 (порция 2)43,5/50 (87) 50 (порция 3) 42/50 (84) 36,6 (порция 1) 32, 9/26,6 (90)36,6 (порция 2) 32/36,6 (87)36,6 (порция 3) 30,8/36,6 (84) Концентрация высоленного полисахаридав дистиллированнойводе,г/мл 2,8/280 2,8/280 2,8/280 2,8/28020 19 1403990 Стадия сушки Стадиякондеясации лон оличетво ичеолич ство ство выходя- конц щего по- трат тока, а мл высуше ого продукта, г акжеромывки2) 1,5 4,5 1-3(пор1) 51403990 23 Продолжение табл,2-2 Стадияконденсации Олыт нцентрация лисахарида Количествовыход(включающая в себя 4 операции) астворе, авшемся в трафильтре,мл (мас,Х/об Стадияхроматографированияна колонке щего потока, атакиепромывк2) Количествоконцентрата,о л МЪ ел еМЮл Юо1 В1а1 РЮ+ИнщР3 Ща. ф ф ЮО О1403990 40 45 50 55 Изобретение относится к химиивысокомолекулярных полисахаридов, аименно к получению полисарахидов наоснове грибов рода Согдо 1 цз, обладающих высокой противоопухолевой активностью при пероральном применениии может быть использовано при производстве лекарственных средств.Цель изобретения - расширениеарсенала биологически активныхсредств,,П р и м е р 1.1-1, Культура грибкового штамма,Штамм (именуемый СМи официально выращиваемый в Японском Государственном исследовательском институте ферментации под номером осаждения РЕВМ-Р 2414) базидиомицетногогрибка Сого 1 цз чегасо 1 ог (Рг) Яце 1вводят в виде затравки в.двадцать200-миллилитровых конических колб,каждая из которых содержала 30 млводного раствора среды культуры, содержащей,мас.Х: глюкоза 5; дрожжевой экстракт 0,3; КЧ, РО 0,1; МАЗОф 7 НО 0,1, и затравочный (прививочный) материал оставляют для выращивания на 10 дней при 25-27 С, Выросшиеслои грибка на поверхности средыкультуры в колбах собирают и гомогенизируют при помощй 20 л физиологического соляного раствора для приготовления рассады культуры грнбковогоштамма в виде суспензии. 20 л полученной таким образом рассады культуры вводят в виде затравки в 1,600 л водного раствора среды культуры, содержащей, мас.Х: глюкоза 10; дрожжевой экстракт 1,5; КНРО 0,1; Мя 80 7 НО 0,1, содержащихся в вертикальном ферменторе объемом 2 м , и затравочный материЪал оставляют для выращивания в течение 7 дней при 26 С. При этом в среду культуры продувают воздух со скоростью 0,5 л мин на 1 л среды культуры и осуществляют перемешивание среды культуры со скоростью 150 об/мин,Полученный таким образом выращенный материал сушат в сушильном аппарате с двойным барабаном, чтобы .получить около 30 кг сухого матери-. ала, содержащего в основном распространяющиеся грибницы грибковогоштамма. Каждые 100 г сухого материалаподвергают следующему процессу дляизвлечения полисахарида,1-2. Извлечение полисахаридаиз сухого материала.Ф100 г полученного таким образомсухого материала подвергают экстрагированию сначала 3 л горячей воды 10 при 95 ф 2 С в течение 3 ч в 5-литровой колбе с мешалкой для перемешивания, и затем содержимое колбы фильтруют для разделения его на грибковый остаток и раствор экстракта.Грибковый остаток промывают при помощи 1 л воды, промывку сочетают сраствором экстракта, что приводит кобщему количеству 3,5 л.Грибковый остаток подвергают эк страгированию при помощи 2 л водныхрастворов едкого натра с соответствующими нормальностями 0,1, 0,2,0,3 и 0,4 при 95 ф 2 С в том же порядке и в той же самой колбе, что и 25 ранее, и после каждой операции эк"страгирования грибковый остаток от.деляют от раствора экстракта и промывают 5 л воды. Промывку комбинируют с раствором экстракта, приводя 30 к общему количеству 22 л, Получают12,3 л водного раствора, содержащего экстракт грибкового штамма. Этотводный раствор, называемый далее водным раствором экстракта, подвергают очистке.35 1-3. Очистка водного раствора экстракта.Очистку упомянутого выше водного раствора экстракта, содержащего полисахарщ, осуществляют или при помощи ультрафильтрации, далее обозначаемой как 1-3-,1, ипи при помощи обратногоосмоса,далее обозначаемого как 1-3-2. 1-3-1. Очистка при помощи ультрафильтрации,Часть (7,2 л) водного раствораэкстракта (12, 3 л), приготовленногоиз 100 г сухого материала, упомянутого выпе, подвергают ультрафипьтрации,при 10 С при помощи введенного водного раствора экстракта в ультрафильтр(типа фильтра Ашдсоцз:2000 ВепеЬ,снабженного мембраной М, котораяпозволяет проходить молекулам только с молекулярным весом менее чем5000, чтобы оставлять водный экст-ракт, содержащий только молекулы с37 1403990 38 ф Н Ф й й й й 4 4 3 7 Ф Ф 333 й Ь й Ф Ю Фф НЕ рдо а ВоА ооффщ цд ой я о ею Ю О ф й ф Я оц е.Ф с ев чщ В рв ы й 4 йсч сЪ сЭ о а о Ъ л сч сч л . к Фо о о л о о о Ъ к о о о сЪ о о о о о к о о 3 о о о е к о о о л о о о о М сЪ Л к к о сЪ л о о о к к к 3 к Ю о о съ л 8 съ о о о о м м к к о Ц о Р И йок о о о а л о о л Ю о о л ЮЮол о 3 сч к о о о а л О о 8 ю л 33 о о 3 к о о о съ о о о съ л о цЪ о о к о о л О о о о о о о л о О о к о в л л, л к46 см1 б Ю о о о сч к о о Ю Ъ л Ю о о съ к о о л о о Ю ю к о о о о о Ю сч Ю .о 3 о Ю о л о о о о сф мв 8 съ к О о о о еч л о о о с к о о о сЪ л о о л о Ю о О о о сч л 8 л Ю о О к 3 о о к сЪ л к 1 оВз5 ю1 О 1 а счо А о о о о о л м В В м 1 о о оо ооо оо л о о о О,трацию,30 35 40 45 50 55 з 14 молекулярным весом не менее чем 5000, и при помощи подачи в него давления. Операцию ультрафильтрации осуществляют 4 раза при давлении 0,5 кг/смй и времени операции 1,5 часа в серии 1-3-1-1; давлении 0,5 кг/см Й времени операции 2 5 ч в серии 1-3-1-29 давлении 3,0 кг/см и времени операции 2 ч в серии 1-3-1-3 и давлении 5,0 кг/см и времени операции,2,5 ч в серии 1-3-1-4.Количество водного раствора экстракта, оставшегося в ультрафильтре, составляет 840 мл (серия 1-3-1- 1), 380 мп: (серия 1-3-1-2), 150 мл (серия 1-3-1-3) и 110 мл (серия 1- 3-1-3) .Водный экстракт, оставленный в ультрафильтре в каждом опыте укаэанной выше первой ультрафильтрации, делят на три равные части (порция 1, порция 2 и порция 3) и добавляют кристаллический сульфат аммония в каждую из порций,тем самым производится высаливание полисахарида, присутствующего в водном экстракте, и самого экстракта. Количество сульфата аммония, добавляемого в каждую из порций водного экстракта, оставшегося в ультрафильтре при проведении каждого из опытов в указанной выше ультра- фильтрации, показано в табл.1-1, и эти данные соответствуют 90 мас.7. от объема водного экстракта в порции 1; 87 мас.7 от объема водного экстракта в порции 2 и 84 мас.Е от объема водного экстракта в порции 3 в каждом из опытов по ультрафильтрации. Полисахарид, полученный в результате проведения стадии высаливания, далее собирают фильтрацией и подвергают растворению в дистиллиро-. ванной воде. Каждый из полученных таким образом водных растворов полисахарида подвергают второй ультрафильтрации в том же самом ультрафильтре, оснащенном той же самой мембраной, как было указано выше, для удаления сульфата ,аммония,оставшегося в полисахариде, полученном высаливанием. При проведении второй ультрафильтрации операцию проводят четыре раза подряд, с тем, чтобы удалить сульфат аммония так тщательно, как только это возможно, из полисахарида, полученного выщелачиванием (табл.1-2). После приложения давления, равного 0,5 кг/см , к водному раствору,гнаходящегося в ультрафильтре в течение периода времени, равного 1,5 ч, что является первой операцией второй ультрафильтрации, производят добавление определенного количества воды к водному раствору, оставшемуся в ультрафильтре, а вторая операция на этой второй ультрафильтрации заключается в создании давления, равного 1,5 кг/см , на ультрафильтре и поддержании этого давления в течение 1,5 ч. После добавления определенного количества воды к водному раствору, оставшемуся в ультрафильтре, давление, равное 1,5 кг/см, снова прикладывают к ультрафильтру, и это давление сохраняют в течение 4,5 ч,что является третьей операцией. Определенное количество воды снова добавляют к водному раствору, оставшемуся в ультрафильтре, и давление, равное 5 кг/см , снова прикла- г дывают к ультрафильтру в течение1 ч, и это является четвертой операцией, завершающей вторую ультрафильКонцентрация полисахарида в водном растворе, оставшемся в ультра- фильтре после завершения стадии второй ультрафильтрации, составляет 10 г/100 мл в том случае, когда вторую ультрафильтрацию проводят на порции 1 каждого опыта; 8 г/100 мп в том случае, когда это касается порции 2 каждого опыта и 3 г/100 мл в том случае, когда это касается порции 3 каждого опыта,Далее каждый из полученных таким образом водных растворов, соот" ветственно остающийся в ультрафильт" ре после завершения второй ультра- фильтрации, на соответствующих порциях каждого из опытов, подвергают хроматографированню, и эту операцию осуществляют путем выливания водного раствора в колонку, заполненную диэтиламиноэтилцеллюлозой с целью адсорбции азотсодержащих материалов,которые являются примесями в водном, растворе. Выходной раствор, который пропускают через колонку и из которого отделяют азотсодержащие материалы с помощью адсорбента в колонке, собирают,затем его подвергают конденсации йри пониженном давлении и далее су 140399010 15 20 25 30 ЗБ 40 красных лучей.1 шат с получением в результате очищенного полисахарида.1-3-2. Очистка при помощи фаз, представленных обратным осмосом.Часть (7,2 л) водного раствора экстракта (12, 3 л), приготовленного иэ 100 г очищенного материала, упомянутого выше, подвергают обратному осмосу. Операцию обратного осмоса осуществляют 4 раза при соответствующих условиях, т.е. давлении 20 кг/см и времени операции 3 ч в серии 1 "3- 2-1; давлении 20 кг/см и времениаоперации 4,5 ч в серик 1-3-2-2; давлении 29 кг/см 2 и времени операции .5 ч в серии 1-3-2-2 и давлении 35 кг/см и времени операции 5 ч в серии 1-3-2-4 и при общих и фиксио рованных условиях температуры 10 С в аппарате для обратного осмоса, снабженного мембраной, которая позволяет проходить только молекулам с молекулярным весом меньше 5000. Эти данные составляют 90 мас.Х от объема . раствора порции 1, 87 мас.й от объема раствора порции 2 и 84 мас.Е от объема раствора порции 3 стадии высаливания по примеру 1, Полисахарид, полученный в результате проведения стадии высаливания, собирают фильтраци" ей и затем подвергают растворению в дистиллированной воде.Каждый из полученных таким образом водных растворов полисахарида из порции соответствующих .опытов подвергают ультрафильтрации в ультра- фильтре, оснащенном мембраной,как и в опыте 1-3-1 для удаления сульфата аммония, присутствующего в вод-ном растворе с использованием той же методики, которая была указана для второй ультрафильтрации в опыте 1- 3 11Водный раствор, оставшийся в ультрафильтре после завершения операций ультрафильтрации, подвергают хроматографированию на колонке с использованием той же методики, которая была указана при проведении хроматографирования на колонке в опыте 1-3-1 для удаления азотсодержащих материалов, содержащихся в качестве примесей в водном растворе; концентрация полисахарида в водном растворе, оставшемся в ультра 4 ильтре после завершения операции ультрафипьтрации, является равной 1 г/100 мп для порции 1;равной 8 г/100 мл для порции 2 и равной 3 г/100 мл для порции 3 по каждому иэ опытов обратимого осмоса (т.е. опытов 1-3-2-1, 1-3-2-2, 1-3-2-3 и 1-3-2-4) .Выходящий раствор, который пропускают через колонку и очищают от аэотсодержащего материала с помощью адсорбента в колонке, собирают, конденсируют при пониженном давлении и сушат с получением в результате очищенного полисахарида.Условия и результаты, полученные при проведении указанной очистки вод ного экстракта, содержащего полисахариц, проведенной в соответствии со способом 1-3-2, представлены в табл,2-1 и 2-2, Раствор, оставленный в аппарате для обратного осмоса после завершения каждого иэ опытов по обратному осмосу, разделен на 3 равные части (порция 1, порция 2 и порция 3) и затем проводят добавление определенного количества кристаллического сульфата аммония; добавление проводят к каждой порции при комнатной температуре и тем самым осуществляют высаливание полисахарида из водного раствора. Количество сульфата аммония, добавляемого в каждую из порций раствора, оставшегося в аппаратуре для обратимого ос" моса при проведении каждого из опытов, представлено в табл.2-1. 1-4, Измерение характеристик предлагаемого полисахарида.Характеристики, включающие структурные характеристики и противоопухолевые активности, полисахаридов, полученные при помощи представлен-. ного выше процесса, .показаны в табл.3-1 и 3-2.1-4-1. Спектр поглощения инфраСпектр поглощения инфракрасныхлучей образца полисахарида измеряют в соответствии со спобом использования таблетки бромида калия. Таблетка, используемая в этом способе приготовлена при помощи смешивания 1 г,КВг с количеством около 1/3 до 1/2мерной лопаточки образца в соответствии с общим способом. Поглощение отмечено при диапазонах, см : 3600 -3200; 2920-2900; 1660-1610; 1460,;1410; 1360; 1230; 1150; 1080; 1060 -990; 925; 840; 755; 705. Поглощениепри 840 см" характерно для О -со7 14 единений сахаридов. Это свидетельст-. вует о том, что данное вещество состоит из глюкозита и. -соединения.1-4-2. Удельное вращение.Оптическое вращение измерено при помощи П-лучей (589 мкм) натрия при использовании 0,25 -ного водного" раствора образца и 5 см элемента ий 5 удельное вращение вычислено (Ы)д из вращения А1-4-3. Молекулярный вес.Молекулярный вес полученного таким образом полисахарида измерен при помощи использования способа ультрацентрифугирования, Результаты показывают,что молекулярный вес всех измеренных образцов находится внутри диапазона от 5000 до 300000. Для измерений использовалось условие равновесия осаждения и синтетической граничной структуры с применением оптической системы интерференции. Экспериментальные условия следующие; концентрация образца, 0,3 растворио теля, М/10 М КС 1; температура 25 С, столб жидкости 1,7 мм; скорость 22000 об/мин, время измерения 5 ч.1-4-4. Составляющая сахарида в полисахариде.Составляющую моносахарида в полученном таким образом полисахариде анализируют следующим образом. В стеклянную ампулу вводят 3 мг образца с добавлением 10 мл З -ного раствора метанола хлористого водорода,метанолиз осуществляют в течение 16 ч при 100 С и затем нейтрализуют хлористоводородную кислоту при помощи карбоната серебра, прореагированную смесь отфильтровывают при комнатной температуре. Фильтрат конденсируют, выпаривают до сухого состояния, остаток растворяют в 0,5 мп сухого пири- дина.Раствор смешивают с 0,2 мл гексаметилдисилаэона и О, 3 мл триметилхлорсилана, и смесь оставляют при комнатной температуре на 30 мин для осуществления триметилсиляции. После ее окончания смесь растворяют в хлороформе, и после удаления избытка реагента при помощи промывочной воды полученный раствор выпаривают до . сухого состояния Остаток растворяют в тетрахлориде углерода и производят анализ при помощи газовой хроматографии. Результаты анализа показывают, что глюкоза составляет более 90 сос 03990 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 тавляющих сахарида данного вещества (полисахарнда), а другие сахариды, такие как манноза, галактоза, ксилоза, фукоза и др. составляют очень малое количество.Для того, чтобы определить конфигурацию (П-форма или ы -Форма) глюкозы, как основной составляющей предлагаемого полисахарида, полисахарид подвергают гидролизу, глюкозу, изолированную от гидролизата при помощи хроматографической колонки, подвергают анализу понижения точки плавления после смеси с подлинным образцом Р-глюкозы. В соответствии с результатами, что точка плавления смеси была той же самой, что и подлинного образца и образца гидролизата, найдейо, что глюкоза предлагаемого полисахарида имеет Э-форму.1-4-5. Структура соединения саха- рида.Структура соединения сахарида в данном веществе определялась в соответствии со способом НочогсЬ.В 1 О мп раствора 1 н, гидроокиси ,натрия растворяют 2 г образца и прио этом раствор поддерживают при 40-50 С в потоке азота и строгом перемешивании, по каплям в раствор в течение нескольких часов добавляют 20 мл диметилсульфата и 40 мл 30 -ного водного раствора гидроокиси натрия и оставляют смесь на ночь. После чего смесь была подвергнута обработке при помощи метилирования с использованием такого же количества агентов метилирования, После нейтрализации реакционной смеси ее,диализируют проточной водой и диализат конденсируют при пониженном давлении и затем подвергают такой же обработке метилированием, как ранее, три раза.После завершения окончательной нейтрализации и диализа полученный диализат выпаривают до сухого состояния при пониженном давлении и остаток растворяют в 20 мл смеси с соотношением 10:1 хлороформа и метанола, К полученному таким образом раствору добавляют смесь с соотношением 1:1 петролейного эфира и простого эфира, чтобы осадить метилированное вещество. Затем 20 мг метилированнаго вещества подвергают гидролизу с водным раствором 1 н.сернойТаблица 1-1 Условия проведения процесса, параметры процесса и некоторыерезультаты, полученные при проведении стадии ультрафильтрации для очистки водного экстракта штамма СИ Согдо 1 цз чегздо 1 ог (Гг) Яце 1 Стадия растворения Стадия высаливания Опыт Стадия первой ультра- фильтрации Концентрация полученноговысаливаДавление,кг/смй Время,ч Количество Количество Количестводобавляемого(мас. /об) порции раствора,мл раствора,оставнием по- лисахарида в ди- стиллированной воде, г/мп шегося в ультрафильтре,мл 1-3-1 1 0,5 3840 280 (порция 1) 1,5 252/280 (90) 2, 8/280 2,8/280 2,8/280 280 (порция 2) 244/280 (87) 280 (порция 3) 235/280 (84) 126 (порция 1) 113,9/126,9 (90) 2,8/280 1-3-1-2 0,5 2,5 380 126 (порция 2) 110,1/126,6 (87) 2, 8/280 126,6 (порция 3) 106,3/126,6 (84) 2,8/280 9 14039кислоты в течение 16 ч при 100 ОС, игидролизат превращают в алдитолацетат в соответствии со способом дляизмерения его молярного отношенияпри помощи сравнения зон пиков егохроматограммы. Для определения разницы между 2,3,б-три-О-метилглюкозой и 2,3,4-три-О-метилглюкозой,20 кг метилированной глюкозы подверогают метанолизу при 100 С в течение16 ч в герметичной ампуле при использовании З .-ного спиртового растворахлористого водорода. В результатехроматографического анализа продукта метанолиза не обнаружено 2,3,4 три-О-метилглюкозы Для подтверждения каждый из разлагаемых продуктовподвергают идентификации с газовойхроматограммой подлинного вещества,при этом каждый гидролизат изолирован при помощи хроматографическойколонки и кристаллизовался или превращался в кристаллические производ-ные вещества. 25 90 10Формула изобретения Способ получения полисахаридов, включающий экстракцню растительного материала, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью расширения арсена" ла биологически активных средств, в качестве растительного материала используют мицелий грибов рода Сог 1 о 1 аз, экстракцию проводят 0,.1-0,4 н. водным раствором едкого натра при 93-97 С, полученный экстракт подвергают ультрафильтрации при давле-, нии 0,5-5,0 кг/см или обратиму осмосу при давлении 20-35 кг/см , затем вводят 84-90 об.сульфата аммония и полученный осадок растворяют в воде до образования 3-10 -ного раствора с последующей его очисткой сначала ультрафильтрацией при давлении 0,5-5,0 кг/см и затем в ионообменной диэтиламиноэтилцеллюлозной колонке концентрированием раствора и сушкой целевого продукта.1403990 Продолжение табл. -1 Стадия высаливания Стадия растворения Опят Конще Количествопорциираствора,мл личество бавляемо рация по- лученного с влив ас.Х/об) 2,8/ 45/50 (90) 43,5/50 (87 42/50 (84) 50 (порция 1) 50 (порция 2) 50 (порция 3) 36,6 (порция 1 1-3 2, 8/280 280 32,9/36,6 (90) 2,8/280 32/36,6 (87) 2,8/280 30,8/36,6 (83) 2, 8/280 36,6 и ия 3 6 лица Ста второи ультрафильтрации Стадияхроматографитадия конденсуш Вреонцентрацияолисахаридарастворе,ставшемся а са ния и кг с Колич Суммароличетв ичесто выходящего пото ка и п мывок,5 2,5/2 5 (10 5 25 (10(мас.7/об) нием полиса харида в дистиллиро-ванной воде, г/мл высушенного продукта, г,5 2,5/25 (10) ,5 2,5/25 (10) 14Продолжение табл. 1-2 СТВО ВЫСУ- аЕИИОГО продуй та г