Способ получения противостолбнячной преципитирующей сыворотки

Союз Советски кСоциалистическихРеслублик 11 ц 741883(51) " КлЛ 61 К 39/08 Государственный комитет Опубликовано 25.06.80. Бюллетень ЛЪ 23Дата опубликования описания 05.07.80ав делам изобретений и открытий(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОСТОЛБНЯЧНОй ПРЕЦИПИТИРУЮЩЕИ СЫВОРОТКИ15 Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения противостолбнячной сыворотки, применяемой в медицине.Известен способ получения противостолбнячной преципитирующей сыворотки путем иммунитации животных - продуцентов возрастающими дозами инактивированной культурой возбудителя столбняка с последующим забором крови и отделением сыворотки 11,Однако сыворотка, полученная таким способом, не обладает высокой специфичностью, так как в ней содержатся антитела и к токсическим и соматическим белкам.Целью изобретения является повышение специфичности сыворотки. Эта цель достигается тем, что исходную культуру многократно обрабатывают смесью 0,9%-го раствора хлористого натрия и 0,4%-го раствора формалина, после инактивации культуру гомогенизируют и полученный гомогенат трахкратно вводят продуценту внутривенно с интервалом в 4 дня и целевой продукт очищают с помощью ионитов. 2Кроме того, целевой продукт очищают сорбцией на ДЭЛЭ-сефадексе Аили геле ДЭАЭ-ЭДиз 0,005 М фосфатного буфера рН 6,0-6,5 и элюируют тем же раствором с 0,4 М хлористого натрия.Способ поясняется следующим примером.Пример. Получение сыворотки осуществляют в несколько этапов.Первый этап получение антигена для иммунизации.Столбнячные микробы штамма 471 (Копенгаген) засевают на казеиново-растительную кислотно-гидролизатную питательную среду. Культивирование проводят 2-4 дня, чтобы получить максимальное количество микробных тел при минимальном содержании токсина при +34 С. Выемки культуры вносят в центрифужные стаканчики и центрифугируют при 3000-5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают ъ 20%-ную едкую щелочь. Осадок 3-5 раз отмывают физиологическим раствором с 0,4% формалина. Отмытый осадок заливают физиологическим раствором с 0,4"/о формалина, помещают на сутки в холодильник при +4 С для экстрагирования токсических белков, центрифугируют, надосадочную жидкость сливают,741883 Формула изобретения Составитель С. МалютинаРедактор П. Горькова Техред К. Шуфрии Корректор Н. ГригорукЗаказ 3343/3 Тираж 573 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж - -35, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,осадок снова заливают физиологическим раствором. Такую обработку проводят до 5 раз.После экстрагирования токсических белков культуру заливают 0,4%-ным водным раствором формальдегида и помещают в термостат на 20 дней при 37 С. Полученную анакультуру четырехкратно отмыва 1 от попеременно дистиллированной водой и физиологическим раствором с центрифугированием при 3000-5000 об/мин. Отмытую анакультуру дезинтегрируют с бусами при 3000 колебаний в минуту; на втором этапе иммунизируют кроликов.Дезинтегрированные микробные тела разводят физиологическим раствором с мертиолятом в концентрации 1:10000 до мутности, соответствующей стандарту мутности 1 млрд микробных тел коли. Иммунизацию проводят с неполным адъювантом Фрейнда. Лдъювант вводят в две точки по 0,5 мл подкожно вместе с антигеном (0,5 мл). Одновременно 0,5 мл антигена вводят внутривенно. Вторая инъекция 1 мл и третья 2 мл внутривенно. Интервалы между инъекциями 4 дня. Кровопускание проводят на 6-ой день после последней дозы.На третьем этапе осуществляют очистку сыворотки. Для этого пати нные кроличьи сыворотки смешивают с ДЭАЭ-сефадексом А - 50 или ДЭАЭ - ЭД - 5 уравновешенным 0,005 М фосфатным буферным раствором рН 6,0 в соотношении 5 г геля на 10 мл сыворотки, экспозиция 30 мин при комнатной температуре. Взвесь фильтруют через маркизет. К филырату прибавляют новую порцию ионообменного геля в количестве 3 г на О мл фильтрата (экспозиция 20 мин, фильтру 1 от через маркизет). Оба осадка переносят в стеклянные емкости и смешивают с 0,005 м фосфатным буферным раствором рН 7,0 в количестве, в 5 раз превышающем объем исходной сыворотки. Взвесь фильтруют через маркизет и дополнительно дважды промывагот таким же объемом фосфатного буфера. Промытый осадок переносят в колонки. Десорбцию антимикробных антител проводят 0,005 М фосфатным буферным раствором рН 7,0 с хлористым натрием в концентрации 0,4 моля. Пробы собирают объемом по 5-7 мл. Окрашенные пробы объединяют и в них вносят консервант (например, мертиолят в концентрации 1:10000).Полученная сыворотка при иммунопроцепитации в агаре со столбнячными анатоксинами вызывает образование линий преципитации, которые пересекались с линией, обф разованной монозональной антитоксическойпротивостолбнячной сывороткой.Предлагаемый способ обеспечивает получение высокоспецифической сыворотки, освобожденной от антитоксического компонента. 1, Способ получения противостолбнячной26 преципитирующей сыворотки путем иммунизации животных-продуцентов возрастающими дозами инактивированной культурой возбудителя столбняка с последующим заборомкрови и отделением сыворотки, отличающий 2ся тем, что, с целью повышения специфичности сыворотки, исходную культуру многократно обрабатывают смесью 0,9/о-го раствора хлористого натрия и 0,4/,-го раствораформалина, после инактивации культуру гомогенизиру 1 от и полученный гомогенат трехи кратно вводят продуценту внутривенно синтервалом в 4 дня и целевой продукт очищают с помощью ионитов.2, Способ по п. 1, отличающийся тем,что целевой продукт очищают сорбцией наДЭАЭ-сефадексе Аили гале ДЭЛЭ-ЭД из 0,005 М фосфатного буфера рН 6,0-6,5 иэлюируют тем же раствором с 0,4 М хлористого натрия.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Руководство гю сывороточному и вакцинному делу, М., 1943, с. 262 в 2.