Способ получения ингибитора протеаз

Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬ 61) Дополнительное к авт, сеид.ву -22) ЗаЯвлено 30.09,76 (21) 2408874/28.1(51 2 О 13 10 присоединением заявки-Государственный номнтет Сооота Мнннстроа СССР оа делам мзоеретаннй а аткрытнн. С, Егоров, М, А, Аль -2) Авторы изобретен сковский ордена Ленни и ордена Трудового Красного Знамени Государственный университет нм, М. В, Ломоносова аявитель) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ПРОТЕ Изобретение относится к ферметпиой нромьпп,ленности, точнее касается способа получения инги.битора протеаз и может быль использовано в меди.плие, гематологии, препаративной и аналитическойбиохиьаи, микробиологии и т. д. бИзвестен способ получения ингибитора протеаз,заключающийся в том, что ВасНЬа сагеоз И 2(РЕВМ - Рй 679) или Васйоз сегецз УМА 1229(РЕВМ - Рй 682) культивируют в питательной среде,которая может содержать в качестве источников 10азота пелтон,бульон, каэаин,кукурузный жстракт,жстракт соевых бобов, а в качестве источниковуглерода - сахарозу, глюкозу, крахмал, декстрин,сусло, Процесс проводят цри 2-38.С и. рн 6-7,5111. 15 неУказанный хтособ является: очень сложным неи дорогостоящим, так как и состав сред в качествеисточников азота входят только белковые формыазота или природные соединения. Кроме того, ингибнтор, полученный этим способом, не обладает подавляющим действием на способность пратеаэ крастворению фибрнна и тромбов крови,Известен также способ получения ингибиторовпротеаз, заключающийся в том, что ппамм Втгерто.чтусеа чоЬсепа ЙВВп 3859 культивируют в аэроб ных условиях глубинным способом на средах, ко. торые могут содержать в качестве источников углерода глюкозу, фруктозу, арабинозу, рафинозу, крах. мал или целлюлозу, глицерин или ннозит, а в ка. ястве источников азота лептон или белковый порошок. Ингибиторы накапливаются в среде на 3 - 4 сутки роста нри нижих температурах (15 - 20 С) и при поддержании рН около 5,0 12),Этот способ также является сложным и доро. гим, так как предусматривает выращивание ироду. пакта на многокомпоиеитных средах, в которых в качестве источнеса азотанспользутог только бел.ковые формы азоте. этом способе наблюдаетсяроста продуцента, а интибитор йствием на фибрино. ую активность протеаз высокая ск обладает литиче скуюдйляющнм де тромболитическ инги би Известен также способ получени ров протеаз, предусматривавапнй сов щивание культуры - продуцента про организма неактивного в отношении ния протеаэ на питательной среде с п отделением клеток от кулатуральной вьщелением из нее целевого нродук местное выраазы и микро. родуцироваосле дующн жидкости та 13,ОЛ ИСАНИЕбаютИЗОБРЕТЕНИЯ605827Этот способ не обеспечивает высокого выхо. Спосс иллюстрируется следующим примером.да ингибитора, подавляющего казеинолитическую, В известную синтетическую среду (глюкоза -фибринолитнческую и тромболитическую активность 0,36%, сахароза - 0,72%, КМОз - 0,2%, М 9804 -микробных протеаэ. 0,123%, Кз НР 04 - 1,37%) после стерилизации вно.Целью предлагаемого изобретения является 5 сят 5% по объему двухсуточного жидкого посевноускорение и упрощение способа получения ингиби- го материала Азрегяцз агугае шгамм 168, выра.тора, обладанацего подавляющим действием на их щенного на жидком 4 бал. сусле, и 5% по объемуказеинолитическую, фибринолитиескую и тромбо жидкого двухсуточного посевного материала Гцзаглитическую активность микробных протеаз, а также цв, охузрогца КМ выращенного на жидком 4 бал, сусле.увеличение выхода ингибитора, 10 Совместное культивирование осуществляется глубинЭта цель достигается тем, что, в способе полу- ным способом в колбах емкостью 750 мл со 100 млчения юггибитора протеаз путем совместного выра. среды на качалках (200 об/мин) цри 28 - 30 С вщивания культуры - продуцентй протеаэ и микро- течение 48 - 72 часов. По ходу развития определяюторганизма неактивного в отношении продуцирова. рН, биомассу, казеинолитическую, фибринолитичесния протеаз на питательной среде с последующим 15 кую и тромболитическую активности. Фибринолитнотделением клеток от культуральиой жидкости и ческая активность культуральной жидкости продувыделением иэ нее целевого продукта, в качестве цента достигает 860 усл, ед/мл; каэвииолитическаякультуры - продуцента протеаз используют Азрег 18,6 каз. ед/мл.и. тромб растворяется за 55 мин,9 цз огугае штамм 168, а в качестве микроорга Не, .стивный организм образует следовые количестниэма неактивного в отношении продуцирования 20ва протеаз, действуинцих ва казеин (0,3.каз ед/мя)протеаэ - штамм Ецзагца охузрогце КМ, и неактивен в отношении фибринолиза и тромболи.Способ заключаетс в совместном выращива зиса. В культуральной жидкости смепанной культурынии двух штаммов микроорганизмов, один иэ ко тромболизис не обнаружен, казеинолитическая ак.торых, Азрегццз огугае штамм 168, активно про тивность равна нулю, а фибринолитическая активдуцирует протеазы с казеинолитическим, фибрино. 2 б ность проявляется лишь в следовых количествах.лнтическим и тромболитическим действием, а дру.той, ппамм Ецзагца охузрогцв, КМ не образуетпротеаэ фибринолитического и тромболитического Формула изобретениядействия, а образует нх ингибитор,30 Огоаоб получения ингибитора протеаз путемПри этом получают посевной .материал каждо совместного выращивания культуры - продуцеитаго из штаммов, вносят этот посевной материал в протеазы и микроорганизма неактивного в отноше;равных количествах в известную сийтетическую сре" нии продуцирования протеаз на питательной средеду, содержащую глюкозу, сахароэу, азотнокислый. с последующим отделением клеток от культуралькалий, сернокислый .ю и двузамещенный фос. 15. ной хащкости и выделением из нее целевого профорнокислый калий. Культивирование смеси микро ,дуктй, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с цельюорганизмов производят глубинным способом при . получения ингибитора, подавляющего казеинолитиисходном рН среды 6,5 - 7,0 в течение 48 72, часов ческую, фибринолнтическую и ,тромболитическуюпри 28 - 30 С, Целевой продукт получают зкстрак- .активность микробных протеаз, а также увеличецией, например органическими растворителями (эта иия выхода а 1 гибитора, в качестве культуры - пронол, метанол) илн актнвированным углем, из куль. дуцешгПротеаз.используют Азрегоцз ргугав штаммтуральной жидкости сьюшаиной культуры микроор 168, а в качестве микроорганизма неактивйого вганиэмов после нредварнтельного отделения клеток, отнош" иии продуцирования протеаэ - ппамм ГцУпрощение способа достигается тем, что выращива: загце охузрогцв КМ,ние смеси грибов производят иа синтетической сре. 46 Источники информации, принятые во вниьа-. де, состоящей всего иэ пяти компонентов (в иэвест. ние при экспертизе;ном 31 способе - сложные среды, содержащие бел. 1. Патент Японии У 49 - 39835, кл. 36(2) со,ковые формы азота и естественные .продукты), а. 1974.ускорение способа достигается тем, что предлагае-. 2, Патент Англии У 1343276, кл. С 3 Н, 1974.мый способ осуществляют за 48 - 72 часа (а извест 50 3, Авторское свидетельство У 436086,ный 13 способ за 72 - 96 часов). кл. С 12 О 13/10, 1972.Составитель Н. СеливерстоваТехред М.Борисова Корректор А.власенкоРедактор О, ИвановаЗаказ 2339/17 Тираж 568 Поднисное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по деламизобретений и озкрызий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4