Способ получения полипептидов

(45) Дата опубликования описания 03,03.78 1) М. Кл.з С 07 С 103 52 Государственный ломит Совета Министров СССРсо делам изобретений) Авторы изобретения вич, М, В, Сидороеева лтухина, Е. И. Филипп и Р, П. Евстиг а Трудового Красног кой технологии им, Г. кой Знамени институтВ, Ломоносова сковский орден химичес(54) СПОСОБ ПО коло 0 се. температуре о перегруппиров я конденсаципентапептиди 20 ч прошла птидов приодвергаютсятого, азиднтрипептида0 - 4 С за азиды пе и выше пКроме щенного р пр защи- лполимелишь на ом0%. Цельпростогония азментовцелевогмя, безса. изобретения - создаи эффективного с дной конденсациина полимере с хо о пептидилполимера, рацемизации, т. е. уп ие нового более особа проведеольших фрагошим выходом а короткое вреощение процесДостигается это способоптида общей формулыВос - Ьуз - 61 у - Тйг -м получения поли - А 1 а -ец Оцз - А Вг 1) - РгО - Р,Н 1 з (Р- Ча 1 -де Р - полимер, аключающийся в том,да общей формулы нденсацию Вос - Ьуз 1 а -Изобретение относится к новому способу получения полипептидов, обладающих биологической активностью, которые могут найти применение в биологии и медицине.В настоящее время широкое распростране ние получил твердофазный метод пептидного синтеза. При этом чаще используют различные виды фрагментарной конденсации пептидов на полимере с последующей очисткой конечного продукта конденсации гель-хро матографи,ей.Основная задача при синтезе пептидов, обладающих специфической биологической активностью - сохранение их оптической чистоты. 15Среди различных методов фрагментарных конденсаций как в растворе, так и в твердой фазе, наиболее надежным с точки зрения предотвращения рацемизации оптически активных аминокислотньх остатков, состав ляющих пептид, является азидный метод.Однако известные примеры азидной конденсации, фрагментов на полимере описывают синтез сравнительно корот 1 сих пептидов, например конденсацию октапептида с пента пептидом, которая требует для своего осуществления длительного времени (6 дней) и высокой температуры (+5 С) и хотя выход продукта конденсации высок (90%), он загрязнен побочными продуктами, поскольку 30 1 ц (Вг 1) - Ьец - Н 1 з (Рпр) -3 35 Заказ 2910 Изд.1029 Тираж 563 Подписное Типография, пр. Сапунова, 2 с пептидилполимеромН - Яег - 61 ц (Вг) - 1.ец - Н 1 з(Рпр) -- Суз (Вк 1) - Азр (ВЕ 1)- Ьуз (У) - 1.ец - Н 1 з (Рпр) Ча -- Азр (Вк) - Рго - Рпроводят в присутствии избытка пентафторфенола при температуре от - 5 до - 10"С.Предпочтительный вариант способа заключается в том, что пентафторфенол берутв 1,6-кратном избытке.Азидная конденсация пептидных фрагментов на полимере в присутствии пентафторфенола проходит за 20 ч, причем выход целевого нонадекапептидилполимера составляетболее 75% и не наблюдается рацемизацияконе шых аминокислотных остатков,Описываемым способом получен нонадекапептид, последовательность амипокислотных остатков в котором соответствует последовательности 82 - 100 3-цепи гемоглобиначеловека, Этот фрагмент входит в состав активного центра з-,цепи гемоглобина, которыйвместе с заключенным в нем гемом, играетважнейшую роль в процессе обратимого связывания и переноса кислорода в организмечеловека,Пример. Получение нонадекапептидилполимераВос - Ьуз(2) - 01 у - Тйг - Рй е - А а - Тйг -- 1.ец - Яег - 01 ц(Вк) - 1.ец - Н 1 я(Рпр) -- гауз(Вке) - Азр(В к) - Ьуз(Я) - 1.ец - Н 1 з -- (Рпр) - Ча - А яр(Вг 1) - РгО - Р,соответствующего последовательности (82 -100) 13-цепи гемоглобина человека.К 25,0 мг (25,5 10 -ммоль)Вос - 1.уз (2) - 61 у - Р 1 те - Тйг - А 1 а -- ТЬг - Ьец К,Н,(четырехкратный избыток по отношению каминокомпоненту) при перемешивании намагнитной мешалке прибавляют 0,17 мл диметилформамида, Образовавшуюся густуюсуспензию охлаждают до минус 30, минус40 С, прибавляют 0,028 мл 5,0 н раствораНС в тетрагидрофуране (5,5-кратный избыток по отношению к гидразиду) и 0,0055 мл(27,5 10 -моль) изоамилнитрита (1,07-кратный избыток по отношению к гидразиду). Перемешивают 50 мин при охлаждении до минус 35 - минус 40 С, нейтрализуют кислоту0,0195 мл триэтиламина до рН 6 - 7. Полнотупереходагидразидав азид определяют по исчезновению положительной качественной реакции реакционной смеси на гидразид. Через 5 -10 мин прибавляют 7,7 мг (41,8 10 -ммоль)пентафторфенола (1,65-кратный избыток поотношению к гидр азиду), перемешивают 40 мин при температуре от - 30 до - 40 С, 30 мин при температуре от - 5 до - 10 С и прибавляют аминокомпонент - аминосвободный додекапептидилполимер. (Г 1 оследний 5 получен из соответствующего Вос-защищенного пептидилполимера, М-концевая аминокислота, определенная дансильным методом - серии) .Реакционную массу оставляют без пере О мешивания при температуре от - 10 до - 5 Сна 15 ч, затем перемешивают при той же температуре 4 - 5 ч. Далее температуру повышают до 20 С и перемешивание продолжают еще в течение 2 ч.15 Пептидилполимер отделяют от раствора,промывают диметилформамидом (4(3 мин Х2 мл), метанолом (3 Х 3 мпн р, 2 мл) и сушат. Получают 22 мг пептидилполимера; 1,8 мг пептидилполимера гидролизу ют при температуре 130 - 140 С в смесипропионовой и 12 н соляной кислот (1: 1) в течение 1 ч, Гидролизат упаривают в вакууме.Количественный анализ гидролизата нонадекапептидилполимера дает следующие соот ношения аминокислот, входящих в гептапептпд и неповторяющихся в додекапептидилполпмере, по отношению к глютаминовой кислоте; Иц (1), Рйе 0,85 (1), 61 у 0,83 (1), А 1 а 0,75 (1). Выход конденсации, считая на глютами- ЗО новую кислоту, составляет 75 - 85% (на Х -концевой серии не считают, так как он частично разрушается при гидролизе). Формула .изобретения 1. Способ получения полипептидов общейформулыВос - Ьуз(7) - Юу - Тйг - Рйе - А 1 а - Тйг -40 - 1.ец - Бег - 61 ц(В 1) - 1.ец - Н 1 з(Рпр) -- бцз - Азр(В 7) - Ьуз(Д) - 1.ец - Н 1 з(Рпр) -- Ча - Азр(Вк 1) - РкО - Р,где Р - полимер, отличающийся тем,45 что, с целью упрощения процесса, проводятконднсацию азида общей формулы 11Вос - Ьуз(У) - 6 у - Тйг - Рйе - А 1 а -- Тйг - 1.ец - К,50 с пептидилполимером формулы 11Н - Яег - 51 ц(Вг) - 1.ец - Н 1 з(Рпр) -. - Суз(Вя 1) - Азр(Вк 1) -- 1.уз(2) - 1.ец - Н 1 з(Рпр) - Ча -55- Азр(Вг) - РгО - Рв присутствии избытка пентафторфенола при( - ) 5 - ( - ) 10 С.2. Способ по п. 1, отл ич а ю щи й ся тем,69 что пентафторфенол используют в 1,6-кратноо м из бы тке.