Штамм вв -1-продуцент гидрогеназы

О П И С А Н И Е (и) 566879ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(23) ПриоритетОпубликовано 30.07.77. Бюллетень28Дата опубликования описания 22.08.77 Гасдарственный комитетСовета Министров СССРно дедам,.изобретенийи открытий) УДК 576,8(088,72) Авторыизобретения71) Заявители Е. Н. Кондратьева, Л. В. Богоров, И Московский государственный ордена Красного Знамени университет и Институт фотосинте) ШТАММ ТН 10 САР 41 А 140 ЯЕОРЕР 81 С 11 ЧАВВ 41-1 - ПРОДУЦЕНТ ГИДРОГЕНАЗЫ ри росте в ет. ТЫосарза ь на простой ргию солнечпользуют мага следующе 1,02,0 1,0 1,0 1,0 10,0 2,0 12 2 г/л 100 30 300 200 10 сы- ер 1Изобретение относится к технической микробиологии и микробиологическому синтезу,представляет собой новый штамм серобактерий - продуцент гидрогеназы, и который может быть использован для получения гидрогеназы, обладающей высокой стабильностьюв отношении кислорода и температуры, с целью разработки биохимических топливныхэлементов и фотосинтетических реакторовдля получения водорода. 10Известен штамм маслянокислых бактерийС 1 оз 1 пйцгп раз 1 ецг 1 апцтп Юз, являющийсяпродуцентом гидрогеназы 111.Однако полученный с помощью этого штамма препарат гидрогеназы обладает низкой 15устойчивостью в отношении кислорода (02) итемпературы, Полная инактивация ферментанаблюдается при хранении препарата на воздухе через 50 - 60 мин н при температурахвыше 25 - 30 С, 20Предлагаемый штамм ТЫосарза гозеорегз 1 с 1 па ВВЬвыделен из белого моря и представляет собой культуру серобактерий.Идентификацию предлагаемого штаммапроводили согласно последнему изданию определителя Берги (Вегдеуз Мапца 1 о 1 Ре 1 егтп 1 па 1 ие Вас 1 епо 1 оду, 1974, И 11 й. Ес 1. ТЬе%1111 атпз %11 Ыпз Сотпрапу, Вайгпоге),Предлагаемый штамм обладает следующими признаками. 3 Морфологические признаки,Чистая культура бактерий пжидкой среде имеет розовый цгозеорегвйс 1 па можно выращиваи дешевой среде, используя энного света, Для выращивания идифицированную среду Пфенниго состава, г/л:КН 4 С 1КН 2 Р 04ХаНСОзМдС 12КС 1ХагЬ 9 Н 20ХаС 111 аггОзСаС 1,микроэлементы 1 мг/л; витаминМикроэлементы, мг/л:Хп 504 7 Н 20МпС 12 4 Н,ОНзВОзСоС 12 6 Н 20СцС 12 2 Н 20И 1 С 12 6 Н 20МагМо 04 2 Н,ОРеС 1 з Выход биомассы составляет 3 г/лрому весу на 5-ые сутки роста), вы3мента - 6,6% (по содержанию белка в исходном экстракте).Клетки культуры ТЫосаряа гояеорегя 1 с 1 па сферические, 1,0 - 1,5 мкм в диаметре. Размножаются бинарным делением, окружены тонкой капсулой, по Граму красятся отрицательно, жгутиков не имеют. Бактерии могут содержать гранулы полифосфатов, поли+оксимасляной кислоты и полисахаридов. При росте на среде с сульфидом или тиосульфатом в клетках откладывается элементарная сера. Фотосинтетический аппарат представлен мембранами везикулярного типа. Содержание ГЦ в ДНК составляет 66,3 - 66,9 мол /ю. Образует бактериохлорофилл А и каротиноиды.Биохимические признаки.Бактерии обладают каталазной и гидрогеназной активностями, а также способностью к азотфиксации, Наибольшая скорость поглощения Н наблюдается в присутствии метилвиологена, а выделения Н - при наличии пирувата или восстановленного метилвиологена, Бактерии не обладают способностью к ассимиляционной сульфатредукции. Рост культур возможен только при наличии в среде Р, 5 - , ЯОз - . Лучшим источником азота является КН 4 С 1. Выдерживают концентрацию ИаС 1 до 15 ю/ю, Ха 5 - до 0,15 ю/ю, МаюБаОз - до 5%, Оптимальная концентрация Иа 50, составляет 0 2 ю/юОтношение к источнику углерода.При росте на среде Пфеннига урожай бактерий увеличивается при добавлении к среде с бикарбонатом и сульфидом или тиосульфатом 0,1 % органических соединений: ацетата, пирувата, лактата, глицерина или глюкозы.П р и м е р. Получение гидрогеназы при культивировании ТЫосаряа гояеорегя 1 с 1 па 6-ти суточной культуры, выросшей на среде Пфеннига с 0,1 ю/ю КН 4 С 1, 0,1 ю/ю Каю 503 и 0,2/ю ацетата в 10-ти литровом ферментере на свету (20 10 эрг/смсек) при 30 С и рН 7,0 - 7,5, клетки осаждают центрифугированием. Полученные клетки (150 г по сырому весу) ресуспендируют в насыщенный аргоном 0,02 М фосфатный буфер рН 7,3 (1;2), Клетки разрушают при помощи ультразвука. Неразрушенные клетки и их частицы удаляют центрифугированием, а полученный исходный экстракт подвергают дальнейшей очистке, включающей следующие стадии; нагревание (75 С в течение 16 мин), фракционирование (ХН 4) 504 (30 - 60/ю насыщения); гель- фильтрацию через сефадекс 6-100 и препаративный электрофорез в полиакриламидном геле. В результате применения на конечной стадии очистки гидрогеназы препаративного электрофореза получается электрофоретически гомогенный препарат фермента с высокой удельной активностью (77,3 мкл Н/мин мг белка) и обладающий высокой устойчивостью к О и температуре.Активность фермента определяют следующим образом. К 1,5 мл 0,05 М К, Ха-фосфат 10 15 20 25 Зо 35 40 45 50 55 60 65 4ного буфера (рН 6,5) добавляют 1 мкмоль/мл метилвиологена, После замены газовой фазы на аргон к реакционной смеси в сосудик добавляют 20 мг/мл дитионита и 0,05 мг/мл фермента. Образование Н измеряют при 30 С из восстановленного дитионитом метилвиологена методом газовой хроматографии. Формула изобретенияШтамм ТЫосаряа гояеорегя 1 с 1 па ВВ 5-1 - продуцент гидрогеназы, хранится в коллекции музея чистых культур кафедры микробиологии биологического факультета Московского государственного университета под ДоМорфологические признаки.Клетки сферические 1,0 - 1,5 мкм в диаметре, окружены тонкой капсулой, жгутиков не имеют. Клетки размножаются бинарным делением, по Граму красятся отрицательно, Бактерии могут содержать гранулы полифосфатов, поли-Р-оксимасляной кислоты и полисахаридов. При росте на среде с сульфидом или тиосульфатом в клетках откладывается элементарная сера.Колонии слизистые, диаметром меньше 1 - 2 мм, дисковидные, розового цвета с ровным краем.Биохимические признаки.Штамм обладает высокой гидрогеназной активностью, измеряемой по поглощению и выделению Н. Гидрогеназа характеризуется высокой термостабильностью (температурный оптимум 75 - 80 С) и устойчивостью к кислороду с периодом полуинактивацин около 6 суток.Культура не обладает способностью к ассимиляционной сульфатредукции,Отношение к углеводам и спиртам.Из сахаров усваивает глюкозу, из спиртов - глицерин.Отношение к кислотам.Усваивает уксусную, молочную, пировиноградную, пропионовую. Слабо усваивает а-кетоглутаровую, яблочную, янтарную.Отношение к источникам азота.Усваивает соли аммония - ИН 4 С 1, (ИН 4) Ю 4, пептон, гидролизат казеина, аргинин.Возможен медленный рост культуры за счет использования нитратов. Нитриты не усваивает. Культура способна к,фиксации молекулярного азота.Желатин не разжижает. Молоко не пептон изирует.Антагонистические свойства.В отношении других бактерий и грибов не проявляет,Источники информации, принятыево внимание при экспертизе1. Ма 1 оя 6., Могепяоп К., Рцгйса 1 оп апй ргорег11 ея о 1 Ьудгодепаяе, 1 гоп яцНцг рго 1 е 1 п, гогот С 1 оя 1 пйцгп рая 1 ецпапцт %ь В 1 осйеппса 1 Ворйуя 1 са 1 Ас 1 а, 1971, 277, 3, 576 - 583.