Способ выделения липазы

(46) Дата опубликования описания 07,09.77(51) М. Кл,е С 07 С 7/026 Гасударственный квинтет Совета Мнннотров СССР по делая нзобретеннй н открытнй) Заявитель Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. М.В. Ломоносова(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИПАЗЫ Изобретение относится к способам полу, чения медицинских препаратов.Йзвестен способ выделений ферментов глицеро-липидного цикла методом афинной хроматографии, где в качестве адсорбента и субстрата используют полимер с гидроксильными группами, этерифицированными длинноцепочечными жирными кислотами, фермент элюируют растворами поверхностно- активных веществ, а затем очищают ацето иом 111.Однако известный способ является трудоемким и многостаяийным процессом, а также не обеспечивает высокой степени чистоты и интактности конечного продукта, 15Белью изобретения является упрошение процесса, а также повышение степени чистоты и интактности конечного продукта.Эта цель достигается тем, что в отличие от известного ранее способа выбран но вый носитель - силикагель с оливковым маслом - высокоселективный к данному липолитическому ферменту а также другой элюент - хлористый натрий. Применение этих двух новых компонентов позволяет избежать поо а цесса дополнительной очистки конечного продукта в ацетоне, который вызывал инактнвацию фермента,Способ пригоден для выделения и очноеки липазы из поджелудочной железы, а также для дополнительной очистки коммерчвских препаратов,На чертеже представлены хроматограммывыделения липазы по предлагаемому способу,гСпособ поясняется следуюшими приме,рами,Пример 1. Оливковое масло наносят напорошок силикагеля, птдрофобизованный лецитином. Предварительно хроматографический силикагель активируют при 120-160 оСв течение 2 час, смешивакл 8 г окликагеля, 0,5 мл лецитина и 6 мл оливковогомасла в эфире,Колонку диаметром 60 мм и длиной 25мм наполняют суспенэней носителя в буфере рН 8,0 (510 М трис-НС 3 с добавкойЭ,З 10 М "аС.е), Уравновешивают колонку тем же буфером до рН 7,8-8,0, что достигается пропусканием буфера через колои560888 дб ФаГ Составитель С. Малютина р О, Иванова Техред Я. Аидрейчук Корректор Е, Паппед ираж 553,твенного комитеелам изобретени ква, Ж, Ра Заказ 1657/138 ЦНИИПИ Госу Подписноеа Совета Минисй и открытийушская наб., д. 4 3035, М иал ПГ 1 П "Патент", г. Ужгород, ул. Проект ку в течение 10 час, Скорость элюировання через колонку 10 мл/час.На колонку наносят 10 мл раствора коммвфщеского препарата липаэы (оптическая плотность раствора 2 при дл че волны 280 нм равна 2,6; удельная активность А в условных единицах равна 16). Эщоирование проводят при комнатной температуре буфером трис-НСХ рН 8,0, отбирая фракции объемом 2 мл. После прекрашения выхода 1 О с колонки белковых фракций при пропусканйи буфера липазную активность элюируют 0,4 МйаС,Й (хроматограмма 1). Происходит эффективное отделение липазы от сопутствующих белков. Легко получается узкая фракция,15 содержащая высокую липолитическую активность (4 мл, В -0,1, А =190 у.е,), Кривая 3 на чертеже показывает липолнтическую активность белковых фракций. Активность по сравнению с исходным препаратом воэ- Ю росла в 12 раз,Пример 2. На колонку длиной 188 мм и диметром 20 мм, приготовленную аналогичным образом, наносят 3 мл водного экстракта иэ делипидиэованной поджелудочной желе зы свиньи ( Э "26, А=0,4 у,е.). Получают 2 фракции, содержащие лнпазную активность (4 мл, Э 0,02, А 320 у,е.). Активность по сравнению с исходным экстрактом возросла в 800 раэ, по сравнению с коммер О ческим Олвинским препаратом в 20 раз (хроматограмма 2),Растворы .охраняют липаэную активность в течение длительного времени при хранении растворов при 4 оС.Предлагаемый способ позволяет повысить сепень чистоты липазы в 12 раэ, исходя из коммерческого препарата, в 800 разиэ экстракта поджелудочной железы, Использование предложенного носителя позволяет выпроводить элюирование носителя хлористым натрием вместо детергентов или желчных солей, которые нарушают нативную структуру белка. ф о р м у л а изобретения Способ выделения лнпазы методом афинной хроматографии, о т л и ч а ю ш и йс я тем, что, с целью упрощения процесса, а также повышения степени чистоты и интактности конечного продукта, в качестве носителя используют силикагель с оливковым маслом, а в качестве элюента - хлористый натрий,Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: 1, Патент франции % 2.220.538, С 07 7/02, 04.10.74,А