Способ определения активности липазы

СТ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОБР К АВТОРСКОМУ СВИД(56) 1. Балаховский С.Д., Балаховский И,С. Методы химического анализа крови. М., Медгиз, 1953, с. 617-620.2.Т 1 еСв Й.И. Е 1 зсо Ч.К. Ргорозей Бсапйагд МегЬой Гог щеазцгщ 1,заразе АсС 1 чу 1 п зегца Ьу а сопсюре Бавр 11 пя гесЬпщце.С 1 ьп сЬешузсгу, 1973, ч. 19, У 11, р. 1268-1275.(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛИПАЗЫ путем добавления к исследуемой пробе субстрата, инкубации смеси в присутствии индикатора с последующим определением продуктов гидролиза субстрата, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышенияточности и ускорения определенияк исследуемой пробе одновременно добавляют в качестве субстрата О, 10,2 мл трибутирина и в качестве индикатора феноловый красный в буферномрастворе с рН 8,4-8,5, инкубациюреакционной смеси проводят в течение30-60 мин, а продукты гидролиза субстрата определяют колориметрически.1091Изобретение относится к медицине,а именно к клинической биохимии.Известен способ определения активности липазы, основанный на определении в сыворотке крови продуктов гидро 5лиза субстрата липазы специфическимицветными реакциями 13,Однако способ трудоемок и требуетдорогостоящих реактивов.Известен также способ определенияактивности липазы путем добавленияк исследуемой пробе субстрата липазы, инкубации смеси и введения в нееиндикатора с последующим определением продуктов гидролиза субстрата 1.2 1. 15Однако метод недостаточно точен,поскольку результат оцениваетсятитрометрически субъективно и длителен. Кроме того, способ применимтолько для определения активностилипазы в сыворотке крови,Цель изобретения - повышение точности и ускорения определения.Указанная цель достигается тем,.что согласно способу определенияактивности липазы путем добавленияк исследуемой пробе субстрата, инкубации смеси в присутствии индикаторас последующим определением продуктовгидролиза субстрата, при которомк исследуемой пробе одновременно добавляют в качестве субстрата 0,10,2 мл трибутирина и в качестве инди. катора феноловый красный в буферномрастворе с рН 8,4-8,5 инкубациюреакционной смеси проводят в течение30-60 мин, а продукты гидролиза субстрата определяют колориметрически.Способ осуществляют следующимобразом.Берут в орошенную антикоагулянтом 40микропипетку цельную капиллярнуюкровь и вносят в изотонический физиологический раствор, центрифугируют.Инкубируют 0,1 мл центрифугата с буфером (рН 8,4-8,5), подкрашенным ф 5феноловым красным и с субстратомтрибутирином (О, 1-0,2 мл). После прекращения инкубации колориметрируютна фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре против воды. Цент Орифугат добавляют в контрольную пробу после инкубации.По изменению цвета реакционной среды по сравнению с контролем судято количестве липазы. 55П р и м е р 1. В центрифуражнуюпробирку вносят 0,2 мл 0,9 -ного,хлористого натрия н 0,2 мл капилляр 065 2нойкрови, взятой из пальца в микропипетку, окращенную антикоагулянтом.Смесь центрифугируют.В две пробирки (опытную и контрольную) разливают по 2 мл буфера, подкрашенного индикатором. В каждуюиз этих пробирок добавляют по 0,2 млтрибутирина, В опытную пробу вносятО, 1 мл центрифугата, слабый гемолизсупернатанта практически не влияетна результаты анализа. Обе пробирки (опыт и контроль) помещают в водяную баню при 37 С на 1 ч. Послеинкубации пробы охлаждают, В контрольдобавляют 0,1 мл центрифугата. Затеми в опыт, и в контроль приливаютпо 3 мл заранее охлажденной дистиллированной воды, Обе пробы центрифугируют 5 мин при 2000 об/мин, Надосадочную жидкость осторожно отсасывают в кювету и колориметрируютпротив дистиллированной Н О при536 нм в кюветах толщиной 10 мм,По разнице экстинкций контрольной иопытной проб рассчитывают количество липазыв образце крови по формулефЕ -Е Ке-Е- ф ф 5 ф 1 20 = - -. - -11 100,Е, Е 1(где Е - экстинкция опыта;Ек - экстинкция контроля;5 - коэффициент пересчета на. 1 мл, трибутирина, 0,2 млтрибутирина вводят в пробу 0,25 1 мл20 - коэффициент пересчета на1 мл крови (расходуется0,1 мл центрифугата, содержащего разведенную в 2 разакровь), поэтому 0,05 мл хх 20 = 1 мл.Реактивы1. Вероналовый буфер рН 8,5:1,545 г мединала (веронала натрия)растворяют в 500 мл воды, добавляют 9 мл 0,1 н, НС 1 и 150 мл0,01 -ного раствора феноловогокрасного. Довобят рН до 8,5, Объембуфера доливают водой до 1 л.(Хранить в холодильнике. Пригоденв течение 1 мес).2. Раствор индикатора:100 мг фенолового красного растворяют в 5,7 мл 0,06 н.йаОН.Послеполного растворения объем индикатора доводят водой до 25 мл. Получают 0,4 -ный раствор. Иэ него готовят 0,01 -ный раствор (9 мл0,4 -ного индикатора доводят до200 мл Н 20).Составитель Е.ЖитниковаТехред И.Метелева Корректор В.Бутяга Редактор Л.филь Заказ 3073/40 Тираж 823 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4 з 1091065 4П р и и е р 2, Больной А. Актив- поджелудочной железы н при дальней- ность липазы в крови, определяемая шем обследовании у больного обнару- предлагаемым способом, составила жен панкреатит. Ек - Ео 5 1 20 05-Од 4 100 Предлагаемый способ позволяет проЕ 0,5водить точное определение активностиПолученные данные свидетельствуют липазы в цельной капиллярной крови о нормальной функции поджелудочной за 1 ч, малотравматичен, не требует железы. дорогостоящих реактивов, что необхоП р и м е р 3. Больной Ь. Актив-. димо в клинической практике для исность липазы составила 75,5 ед, что 1 б следования состояния подкелудочной свидетельствовало о нарушении функции железы.