Способ репродукции арбовирусов в членистоногих

Оп ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ г Союз Советских Социалистических Республик(4 б) Дата опубликования описания 11.04.77 М, Кл.С 12 К 1/00С 1 эК 1/10 сударстаенный комитетсвета Министров СССРпо делам изобретенийи открытий 3) УДК 576.858.25.083.1: 576 .895.2 (088.8) Авторыизобретения ко и В. У. Кален ков, Л. П. Х П, Мишаева, В. И. В(71) Заявит ский научно - исследовательский институт эпидемиологии и микробиолог(5 ПОСОБ РЕПРОДУКЦИИ АРБОВИРУС В ЧЛЕНИСТОНОГИХ нтальнои био- репродукции зобретение относится к эксперим менно к спосостоногих. о нече аемоск. Тавен,роме удителього до В голодных же клещах вирус не тр его постепенно падает, особенн при длительном ц логии и медицине, а и буарбовирусов в члениСпособ может быть применен для изучения взаимоотношений между возбудителями различных инфекций с переносчиками, изучения генетическихпризнаков арбовирусов, влияния действия различных веществ,в том числе ингибиторов на репродукцию вируса в клещах, а также для изучения спонтанной зараженности переносчиков в природных оча Огах инфекций 1 и 2.Известен способ, репродукции арбовирусов, например вируса клещевого энцефалита, в членистоногих,заключающийся в кормлении голодных самок наконтрольных мышах в течение 36 час, введении им 1 бвируссодержащей . взвеси с последующим подсаживанием инфицированных самок клещей на здоровыхмышей для дальнейшего кормления.Интенсивное размножение вирусов, особенно группы клещевых энцефалитов, происходит в организме роклеща во время питания на теплокровных животныхв период бурного роста тканей и органов членистоногих,размножается и хранении переносчиков, когда вирус невозможно обнаружить существующими вирусологическими методами даже у заведомо инфицированных клещей.Недостатком известного способа является трудоемкость и длительность проведения операции по репродукции арбовирусов в клещах. Клещей следует кормить на белых мышах в течение 36 час индивидуально, затем клеща необходимо вырезать с кусочком кожи мьпии и ждать 30 - 40 мин до освобождения соботка от кожи, после освобождения хоботка следует подсадить его, например, на аппарат Алексеева, на котором ротовые части клеща вводят в капилляр с кормовой жидкостью. Все время, пока клещ питается (от 4 мин до 17 мин) необходимо следить за перемещением диска на экране проекционного микроскопа, чтобы определить скорость и время питания, а также объем поглощаемой жидкости. После того, как клещ перестал всасывать предлагаемую ему смесь, е обходимо опять поместить на мышь (лучше 1 - 2 суток, чтобы увеличить процент присасыв ти) и кормить до полного насыщения 5 - б сут ким образом, известный способ малоэффекти требует большой затраты времени и сложен. К того, этим способом невозможно ввести возб в процесс диапаузы, анабиоза или послелиночн522231 ЦНИИПИ Заказ 4555/314 Тираж 575 Подписнов Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 развития клеща. На мышь для подсадки клеща прикрепляется наклейка или стеклянный колпачок, что создает дополнительные технические трудности. При таком способе заражения размножение вирусов наблюдается не в голодных, а в напитавшихся клещах,Целью изобретения является усиление репродукции вируса при снижении материальных затрат.Поставленная цель достигается тем, что самкам клещеи после введения взвеси или одновременно с введением дополнительно вводят в гемоцель раствор Хенк са или телячью сыворотку с последующим выдерживанием клещей при 36-38 С в течение 5 - 7 суток.Введение стимулирующего вещества может, например, осуществляться на универсальном аппарате для парентерального введения жидкостей членисто. ногим, изготовленном в Белорусском НИИЭМ. На введение стимулирующего вещества одной особи требуется 10 - 20 сек.П р и м е р 1. Голодным самкам П. Отцегзотц, перелинявшим из нимф, после насыщения вводят парентерально дозу вирусов 5,25 Кцтв в в 0,03 мл. После превращения в имаго титр вирусов в кле. щах равен 3,25 ц тв 50. Через месяц после линьки клещам вводят в гемоцель по 1,0 мкл раствора Хенкса. Такую же партию клещей (25 экземпляров) оставляют для контроля ( без стимуляции ). Клещей обеих партий содержат после стимуляции при 37 С в течение 7 суток, затем их исследуют вирусологи- чески. Титр вируса в стимулированных клещах равен 4,75 + 33 Ю,. а в контрольной группе - 3,00 + 0,25 3 р0 Д в 50 в 0,03 мл, Различия статистически досто. верны, Р0,01.П р и м е р 2, Голодных самок ( 00 экз) Н,Оголтела га заражают вирусом КЭ (доза 2,50о в 50 в1 35 0,03 мл). Через 15 суток после инфицирования 50 самкам вводят в гемоцель по 1,0 мкл телячьей сыворотки, Такая же партия самок, которым сыворотку не вводят, служит контролем, Через 7 суток содержания клещей при 37 С исследуют обе партии40 клещей. Титр вируса в опытных клещах равен 5,00 ++0,50 ц тв -0, а контрольных - 2,00+0,661 Ц тв 5 вв 0,03 мл. Различия статистически достоверны, Р 0,01Приме р 3. Голодныхнимф О,тйапЬа 1 а (40экземпляров) заражают вирусом КЭ в объеме 1,0 мкл 4510% - ной взвесью мозга больной мыши, Через 7 суток 20 клещам (опыт) вводят в гемоцель по 5,0 мклтелячьей сыворотки, после чего клещей содержат при37 С. Титр вируса в клещах в момент стимуляциио3,34 1 даваов 0,03 мл. Через 7 суток обе партии брклещеи исследуют повторно. Титр вируса в опытныхклещах 6,00+ 0,79 Иф в 50 в 0,03 мл в контрольных - 3,50 + 0,43 йр в 50 в 0,03 мл. Различия статистически достоверны Р 0,01. Усилие репродукции вируса наблюдается не только при введении стимулирующего вещества информационным клещам, но и при одновременном введении здоровым голодным клещам смеси вируса с раствором Хенкса или сыворотки. П р и м е р 4, Смесь вируса КЭ (10% - ная суспензия) с раство зом Хенкса вводят голодным самкам Р. адйегяоттт. в дозе 10,0 мкл. Исходная доза вируса - 5,36 ц в 50 0,03 мл. 5 суток клещей содер. жат при 37 С и 2 суток при комнатной температуре, после чего их исследуют. Титр вируса в клещах увеличивается до 8,5 Я в 50 в 0,03 мл.П р и м е р 5. Голодным самкам П. алс 1 егвотть (50 экземпляров) вводят по 0,1 мкл смеси вируса КЭ (10% - ная суспензия) и телячьей сыворотки. Средний титр вируса (по двум титрованиям) в клещах через 1 час после введения равен 3,87+ 0,35 Рц тв 5 в в 0,03 мл. Через 7 суток содержания при 37 С клещей исследуют повторно, Титр вируса КЭ увеличивается до 5,75 + 0,30 1 Я иво в 0,03 мл, Различия статистически достоверны, Р ( 0,05.Приведенные примеры не исключают возможности применения других стимуляторов, вызывающих размножение вируса в организме голодных клещей, без отхода от основной идеи.Предлагаемый способ позволяет значительно снизить затраты при осуществлении способа, особенно на лабораторных животных, и одновременно характеризуется усилением репродукции вируса в клещах,Формула изобретения Способ репродукции арбовирусов в членистоногих, например вируса клещевого энцефалита, вклю. чаютий введение голодным самкам клещей вирус" содержащей взвеси, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью усиления репродукции вируса при снижении материальных затрат, самкам клещей после введения взвеси или одновременно с введением дополнительно вводят в гемоцель раствор Хенкса или телячью сыворотку с последующим вьщерживанием клещей при 36-38 С в течение 5-7 суток. Источники информации, принятые во вниманиепри экспертизе: 1, " Лабораторное культивирование, исследованиеи заражение иксодовых клещей ", Методические рекомендации МЗ СССР, г. Свердловск, 1972 г стр. 15.