Способ определения устойчивости растений хлопчатника к вилту

11 5 И 9 У Соиз Советских Соцналнстнческнх Гесоублнк) Заявлено 29.10,74 (21) 2070793/30-15 с присоединением заявки М Гасударственный хомнте Совета Мнннстров ССС) ЪД 1; 6,э 1 л 2(088.8) юллетень го 1 бретани о делам н ткрытн ата опубликования описания 08.06.(72) Авторы изобретения А. П. Ибрагимов, Ш, А, Арипджанов, Т. А. УсманМ. Х, Камилова и А. С, Рысбаеванститут биохимии АН Узбекской ССР и Институт -ащиты 71) Заявител стений(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ У РАСТЕНИЙ ХЛОПЧАТНИКА ТОЙЧИВОСК ВИЛТУ 2,0 О,1 0,1 0,0 Изобретение относится к области селекции растений.Известен способ определения вилтоустойчивости хлопчатника путем тестирования растений на устойчивость к Чег 11 с 1111 цт ЙаЫ 1 ае.Цель изобретения - ускорение процесса определения и повышение его точности.Предлагается способ определения вилтоустойчивости, при котором проводят гибридизацию молекулярной ДНК, выделенной из хлопчатника с меченой ДНК - С", выделенной из Ъег 11 с 1111 цт с 1 аЫ 1 ае, и по степени гибридизации судят о степени вилтоустойчивости.Способ осуществляется следующим образом.Проводят выделение ДНК из двухдневных этиолированных проростков хлопчатника сорта 108-Ф, для чего проростки фиксируют в жидком азоте и растирают до получения тонкорастертой муки, Берут 5 г этой муки и добавляют к ней 50 мл раствора, содержащего 1 М хлористый натрий, 1/о-ный додецилсульфат натрия, 0,1 М трис,005 М Ха-ЭДТА, который перед добавлениемнагревают до 40 С. Смесь тщательно перемешивают, растирают в течение 10 мин, затем отделяют водно-солевую фазу и проводят депротеинизацию один раз водонасыщенным фенолом рН 7,5 - 8,0 и 2 раза хлороформизоамиловым спиртом в соотношении 24: 1, отделяя каждый раз водносолевую фазу при 5000 об/мин в течение 30 мин при 2 - 4 С. Далее проводят осаждение ДНК охлажденным 96 этанолом. Удаление примесей РНК остаточных белков проводят паикреатич:ской рибонуклеазой, которую предварительно прогревают при 90 С в течение 10 мин, и лроназой при 37 С в течение 60 мин. Затем проводят окончательную депротеинизацгпо один раз фенолом и два раза О хлороформизоамиловым спиртом. Выделенную ДНК подвер.агот осаждению по методу . армура.Для этого к 00 м,; раствора ДНК добавляют 57 мл изопропансла, содержащего 0,001 М 5 Хав-ЭДТА и 3 М СНСОО 1 ча.После этого проводят перекристаллизациюДНК из стандартнсго солевого раствора (ССР:0,15 М аС 1-,-0,15 М цитар натрия), Гриб Ъег 11 с 1111 цгп йаЫ 1 ае Янги-Юльского 20 штамма выделяют из хлопчатника сорта108-Ф и выращивают в течение 11 дней на среде, содержащей, г л:Хлористый калий 0,5 Сернокислый магний 0,5 Фосфорнокислый калий 1,0 Однозамещенныйянтарнокислыи ам мои ийСернокислое железоСернокислый цинк30 Ферментативный пептон 3511917 Источники ДНК Активность, о Бет 11 с 11 Нит с 1 аЫ 1 ае (гриб)Яер. Мех 1 с а пи тГ 0 Ташкент 108-ф 100 5,132,058,063,3 СФормула изобретения Составитель Л. Марченкова Техред 3, Тараненко Корректор А, Степанова Редактор А. Купрякова Заказ 1251/14 Изд. Жв 1296 Тираж 723 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Раушская наб., д. 4/5Типография. пр, Сапунова, 2 Для выделения меченной ДНК гриба в 100 г культуральной массы вносят 2 мг пред.цествецника биосинтеза нуклеиновых кислот -- тимен С" и выращивают в культуральной среде путем встряхивания в 5%-ном растворе сахарозы в течение 24 час. Получают ДНК активностью 6000 в 70 имп/мин на мг ДНК, Далее проводят молекулярную гибридизацию ДНК, выделенной из хлопчатника с меченной ДНК-С" гриба, Для этого ДНК хлопчатника и меченную ДНК-С" гриба в соотношении 100: 1 растворяют в 0,12 М натрийфосфатном буфере с рН 6,8 и озвучивают при помощи ультразвукового диспергатора типа УЗДНдва раза в течение 3 мин (35 кгц, 0,8 а), денатурируют при 100 С в течение 10 мин и инкубируют в термостате при 60 С в течение 24 час. Затем смесь охлаждают льдом и разделяют на две равные части, одну из которых осаждают 5/-ной ТХУ (трихлоруксусной кислотой), а вторую часть доводят до 4 объемов ССР и наносят на миллипоровые фильтры размером 15 мм. Далее фильтры промывают под вакуумом 4 - 5 раз 10 мл раствора 0,003 М трисбуфера, рН 9,2, до исчезновения радиоактивности в истекающем растворе, После этого фильтры высушивают при комнатной температуре и измеряют их радиоактивность на счетчике типа ПСТс эффективностью 6 - 8%.Расчет активности каждого фильтра проводят, принимая за 100/, активность той части ДНК, которую осаждают 5/,-ной ТХУ. Полученные результаты представлены втаблице. 15 Как видно из таблицы, процент гибридизации ДНК хлопчатника с ДНК-С 4 вирулентного гриба зависит от степени вилтоустойчивости растения, и по мере снижения вилтоустойчивости процент гибридизации увеличивается.20 Способ определения устойчивости растений 25 хлопчатника к вилту, включающий тестирование их на Чег 11 с 111 шгп с)ап 11 ае, отл ич а ющ и й с я тем, что, с целью ускорения процесса определения и повышения его точности, из растений хлопчатника, взятых в фазе пророст ков, выделяют ДНК и проводят ее гибридизацию с ДНК-С", выделенной из Чег 11 с 111 шгп с(а 111 ае и по степени гибридизации судят об их устойчивости.