Способ получения стимулятора иммуногенеза

(33) ФранцияОпубликовано 25.05.75, Бюллетень19 Государственный комитет Совета Министров СССРпо делам иэооретенийи открь Дата опубликования описания 03.09.75(2) Авторы изобретения ИностранцыАрлетт Адам, Франк Милан Бержер, ЛуЭдгар Ледере и Жан Франсуа П(Франция)Иностранная фирмаАжанс Насьональ де Валоризасьон де Л(Франция) едэд,) Заявител еше ш СОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА ИММУНОГЕНЕЗ 54 Изобретение относится к области медициныи касается стимуляторов иммуногенеза,Известен способ получения стимулятора иммуногенеза путем гомогенизации микроорганизмов типа МусоЬасег 1 а или Хосагс 11 а и обработки гомогената органическими растворителями.Целью изобретения является снижение токсичпости препарата.Для достижения поставленной цели гомогенат перед делипидизацией обрабатывают протеолитическими ферментами, лиофилизируют, обрабатывают ацетатом аммония, повторно подвергают обработке протеолитическими ферментами и лиофилизации, а затем растворяют в воде и фракционируют, например,с использованием сефадекса Ст - 50.П р и м е р 1, Штамм МусоЬас 1 ег 1 цтпзшерпа 11 з, культивируют в склянках Рюксана среде Саутона в течение 12 дней, при 37 С, 20отфильтровывают, промывают дистиллированной водой и до непосредственного использования выдерживают при 20 С.100 г клеток суспензируют в 500 мл дистиллированной воды путем смешивания при низких температурах в смесителе Уаринга, который предварительно охлаждают до тех пор,пока суспензия не становится гомогенной. Затем эти клетки расщепляют в предварительно охлаждаемом французском прессовом устройстве, работающем в условиях комнатной температуры при давлении 420 кг/см. После первоначального прохождения через прессовое устройство добавляют 1 мг РХА-зы для снижения вязкости, и затем эту суспензию вторично пропускают через то же устройство. Кроме расщепления клеток путем воздействия механического давления, они могут быть расщеплены также звуковым колебанием 30 мл суспензии в течение 25 мин в звуковом осцилляторе, предварительно охлажденном и работающем с частотой колебаний 70 кгц/сек, а также замораживанием оттаиванием при обработке их цеолитом, встряхиванием их вместе со стеклянными шариками или обычными средствами, используемыми для расщепления микробных клеток.Получаемую в результате суспензию центрифугируют три раза в течение 15 мин в количестве 800 г в охлаждаемой центрифуге. Шарики, состоящие из нерасщепленных клеток, удаляют. Получаемую всплывшую на поверхность жидкость центрифугируют в течение 1 час в количестве 27500 г. Шарики из47170 1 Предмет изобретения Составитель С. Шенева Техред 3. Тараненко Корректор Л. Котова Редактор Д. Пинчук Заказ 2098/16 Изд. ь 1 з 747 Тираж 559 Иодгпсное Ц 11 ИИГ 1 И Государственного когиитета Совета Министров СССР по дела:я изобретений и открытий Москва, К-З 5, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 всщества стенки клеток превращают в суспензию 750 мл буферного раствора фосфата натрия (0,066 М; рН 7,8), в которую добавляют 125 мл трипсина, 125 мл химотрипсина и небольшое количество антисептического агента (например, толуол), чтобы предогвратить какое-либо бактериальное загрязнение. Этот продукт выдерживают в инкубаторе в течение ночи при обычной комнатной температуре с помощью магнитной мешалки, и после этого смесь центрифугируют 1 час. Шарики, состоящие из вещества стенки клеток, промывают, помещая их снова в суспензию, центрифугируя три раза вместе с холодным буферным раствором фосфата и три раза вместе с холодной дистиллированной водой.Далее вещество стенки клеток делипидируют при обычной комнатной температуре с помощью нейтральных растворителей, С этой целью материал помещают в суспензию примерно в 30 объемов растворителя, который может воздействовать примерно в течение одного дня при перемешивании, Вещество стенки клетки, таким образом, делипидируют три раза ацетоном, три раза этанолом-эфиром (1: 1), три раза хлороформом и три раза хлороформом-метанолом (2:1), затем это вещество высушивают с помощью ацетона, Делипидированное и высушенное вещество степки клетки до его непосредственного использования можно выдерживать при комнатной температуре,100 г делипидированного вещества стенки клетки суспензируют в 250 мл 0,1 М-ного раствора ацетата аммония, с рН 6,2 и выдерживают эту суспензию в течение ночи в холодном состоянии, добавляя несколько капель толуола. Вещество фильтруют, используя фильтр из сплавленного стекла, промывают этанолом и хлороформом. Промытый материал помещают снова в суспензию в 150 мл ацетата аммония (0,1 М; рН 6,2), к которому добавлено 12 мг лизозима и несколько капель толуола; этот продукт выдерживают в течение ночи в инкубаторе при 37 С и перемешнвапии. После фильтрации с помощьюсплавленного стекла остаток обрабатываютеще раз лизозимом в тех же условиях, чтои первоначально.5 Оба фильтрата смешивают, лиофилизируют,снова растворяют в воде и лиофилизируют доудаления ацетата аммония. Выход; примерно90 мг сырого растворимого в воде продуктана 1 г высушенного делинидированного ве 10 щества стенки клетки,Растворимый в воде сырой продукт(500 мг) фильтруют через колонку, наполненную Ьерйадех 6-50 (высота колонки 80 см,диаметр 2,5 см) в равновесии с 0,1 Х-ной ук 15 сусной кислотой.Первый пик выходящего из колонки продукта, хорошо отделенного от оставшегосяпродукта, содержит рассматриваемый в данном описании агент в чистом виде (150 мг).20 Фильтрация через колонку, наполненнуюЬерЬадех 6-75, приводит к более размытомупику выхода, включающему плечо.Этот пик выхода продукта содержит двефракции одинакового состава, различающиеся25 лишь по молекулярному весу.Франкции, соответствующие второму пикувыхода продукта при фильтрации через колонку, наполненную 5 ерЬас 1 ех Сгсодержатвещества с более низким молекулярным ве 30 сом,Способ получения стимулятора иммуногене за путем гомогенизации микроорганизмов типа МусоЬас 1 ег 1 а или 1 чосагйа и делипидизацпи гомогената, отличающийся тем, что, с целью снижения токсичности препарата, гомогенат перед делипидизацией обрабатыва ют протеолитическими ферментами, лиофилизнруют, обрабатывают ацетатом аммония, повторно подвергают обработке протеолитическими ферментами и лиофилнзации, а затем растворяют в воде и фракционируют, напри мер, с использованием сефадекса 6-50.