Способ получения биологически активных веществ, содержащихся в дрожжевб1х клетках

ятот с, т;, ."охиичесиангцгътотеЙ"фО ПИЗОБРЕТЕНИЯ 225022 Союз Советских Социалистических РесптбликК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ висимое от авт, свидетельства М аявлено 02. Х.1965 1 25155/28-13), ба, 22/05 с присоединением заявки г,е комитет по деламобретений и открытийри Совете МинистровСССР МПК С 1%УДК 663.14.038.9(088 8 Приорит Опубликовано 03.71.1970. Бюллетень ЛЪ 22Дата опубликования описания 19.Х,1970 Авторы:зобретения Р. П. Евстигнеева, В. Н, Гурышев, М. Е. Гальперин и Л. Н. Волосевич овский институт тонкой химической технологии им, Ломонос Заявител ИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕРОЖЖЕВЫХ КЛЕТКАХ ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛ СОДЕРЖАЩИХСЯ В Известен способ получения биологически активных веществ (например, ферментов, витаминов), содержащихся в дрожжевых клетках. Согласно этому способу клетки дрожжей разрушают этилацетатом, полученную суспензию разделяют одним из известных способов, например фильтрацией, получая при этом жидкую и твердую фазу, Из твердой фазы высаливают растворимые вещества раствором сульфата аммония. Жидкую фазу разделяют фильтрацией на фильтрат и белковый осадок.Предлагаемый способ обеспечивает получение более широкого комплекса содержащихся в дрожжах биологически активных веществ, иапример ферментных препаратов - цито- хрома С, рибонуклеазы, рибонуклеиновой кислоты, эргостерина - источника витамина Р, С этой целью цитохром С выделяют из филь- трата путем пропуска последнего через ионообменные колонки с последующим элюированием уловленного на них цитохрома. С. Рибопуклеазу выделяют из раствора, прошедшего через колонки, осаждением риванолом с последующим получением ее из осадка в кристаллическом виде.Рибонуклеиновую кислоту получают путем ооработки белкового осадка щелочью, а эргостерин - путем воздействия на белковый осадок спиртом.Согласно предлагаемому способу колонки заряжают смолами СГ, КБ, КБи КБ,Высалпванпе растворимых веществ из осадка следует вести 50%-ныхт раствором сульфата аммония при температуре 10 - 15 С.П р и м е р. К 10 г прессованных дрожжей 5 вида Ьас)тагогпусез сегелз)е добавляют 3,225 гэтплацетата и оставляют на. час при 10 - 15 С.Затем полученную суспензию фильтруют.Осадок суспендируют в растворе сульфата аммония (3,225 кг сульфата аммония раство ренного в 15 л воды, 50% от степени насыщения). Экстракцп 1 о раствором сульфата аммония проводят в течение 48 час прп перемешиванпи и температуре 10 - 15 С.Белковый осадок отдсляют, а фильтрат диа лизуют в течение Зб час.Для получения цитохрома С фильтрат пропускают через колонку с ионообменной смолой при рН 7,0. При этом цитохром С выделяется на смоле, а рпбонуклеаза в растворе 20 проходит через колонку. Колонку промывают3 л 0,05 М раствора сульфата аммония, после чего элюпруют раствор цптохрома 1,5 л 0,2 М раствора сульфата аммония, Полученный раствор цитохрома С диализуют в тече ние 18 час, фильтруют, затем пропускают через колонку с понообменной смолои при рН 7,0. Колонку промывают 500 лг,г 0,25 - 0,3 М аммонийно-ацетатного буфера, после этого элюпруют 0,5 М раствсром аммиака (б 00 - 30 800 лг,г). Вначале элюируется восстановленная форма цитохрома С, потом окисленная,275027 Предмет изооретения Составитель Андреева Редактор Торопова(орректор Н. Л. Бронская Заказ 3013/6 Тираж 480 ПодписноеЦНИИПИ 1(омитета по делам изоорстепий и открызий пои Совете Министров СССРМосква, Ж, Раушская паб., д. 45 Типография, пр. Сапунова, 2 Полученный раствор диализуют в течение 18 час и пропускают через колонку с ионообменной смолой (КБ, КБ, КБ, СГ) при рН 9,6 для концентрирования. Элюацию проводят 0,5 М водным раствором аммиака (100 - 150 лл), Концентрированный раствор цитохрома С подвергают лиофильной сушке,Для получения рибонуклеазы,к раствору, прошвдшему через первую колонку, объем которого составляет 15 л, доливают при перемешивании 5,6 л 1%-ного водного раствора риванола и оставляют при температуре не выше 10 С на 2 час.Образующийся комплекс рибонуклеаза -- риванол выпадает в осадок, который отфильтровывают, Осадок 113 г) растворяют в 5 л 1 М раствора ацетата натрия, прибавляют 2 объема ацетона и держат на холоде в течение 24 час. Выпавшие кристаллы рибонуклеазы отфильтровывают 113 г) .Осадок растворяют в 100 мл воды, раствор охлаждают и доливают к нему при перемешивании двойной объем апетона. Оставляют на 12 час при охлаждении, после чего фильтруют. Переосаждение повторяют еще раз. В результате получают 7 г кристаллической рибонуклеазы.Для получения рибонуклеиновой кислоты белковый осадок, полученный после экстракции цитохрома С и рибонуклеазы сульфатом аммония, промывают 5 л воды на фильтре, затем суспендируют в 7 л 2 н. раствора едкого натра, Экстракцию рибонуклеиновой кислоты щелочью ведут при перемешивании в течение 1 час. Затем приливают 1100 лл ледяной уксусной кислоты, доводя р 1-1 смеси до 6,0, и фильтруют,К полученному фильтрату приливают двойной объем спирта в количестве 4,5 л. Спустя 4 час осадок рибонуклеиновой кислоты отфильтровывают и получают 180 г ее, Затем рибонуклеиновую кислоту растворяют в1600 лл воды, осаждают одинарным объемомспирта и фильтруют.Для получения эргостерина фильтрат, полу ченный после удаления рибонуклеиновой кислоты, обрабатывают спиртом.Выход цитохрома С 200 мг, рибонуклеазы7 г, рибонуклеиновой кислоты 70 - 80 г, эргостерина 16 г.10 1, Способ получения биологически актив ных веществ, содержащихся в дрожжевыхклетках, путем разрушения их этилацетатом, отделения твердой фазы от жидкой одним из известных способов, высаливания растворимых веществ из твердой фазы раствором 20 сульфата аммония, разделения жидкой фазыпутем фильтрации на белковый осадок и фильтрат, отличающийся тем, что, с целью получения более широкого комплекса содержащихся в дрожжевых клетках биологически ак тивных веществ, например ферментных препаратов - цитохрома С, рибонуклеазы, рибонуклеиновой кислоты, эргостерина - источника витамина 1, цитохром С выделяют из филь- трата при помощи ионообменных смол, напри мер КБ, КБ, КБ, СГ, рибонуклеазу получают из раствора, освобожденного от цито- хрома С, осаждением риванолом с последующим получением ее в кристаллическом виде из осадка одним из известных способов, а рибо нуклеиновую кислоту и эргостерин получаютпутем последовательной обработки белкового осадка щелочью и спиртом.2, Способ по п. 1, отличающийся тем, чтовысаливание растворимых веществ из осадка 40 ведут 50%-ным раствором сульфата аммонияпри температуре 10 - 15 С.