Способ получения -1, 6-гликозидаз

0 П И С А Н И Е п 11 469267ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(33) ЯпонияОпубликовано 30.04.75. Бюлл осударстееннын комитет овета Министров СССР по делам изобретенийн открытий ень МДата опубликования описанп 1.7(72) Авторы изобретения Инос аме Сугимото, Мамору Хиранц цуо Масуда и Сузо Сака(71) Заявитель Иностранная фпрп Хаясибара Компанермостабильност стретсяпецифичность к субстратам:Картофельный крахмал Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению ферментов с помощью микробного синтеза,Известен способ получения а,6-глюкозидаз путем культивирования их продуцентов 5 на водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганическиесоли.С целью повышения выхода а,6-глюкозидаз предлагается в качестве продуцента ис пользовать штамм М 1 сгососсцз 1 узоде 1 с 11 сцз 1 РО 3333.Сущность описываемого способа заключается в том, что штамм выращивают в питательной среде, содержащей растворимый крахмал, 15 пептон, дрожжевой экстракт, соли фосфора, магния, натрия и железа, в условиях аэрации на качалке при ЗОС.Рост определяют по изменению коэффициента поглощения культуральной жидкости, 20 разведенной 10 раз, при длине волны 660 ммк, рН измеряют потенциометрически.Активность фермента определяют следующим образом: к реакционной смеси, содержащей 5 мл 1%-ного раствора растворимого ри сового крахмала и 1 мл (0,5 моль) ацетатного буфера, добавляют 1 мл раствора, содержащего испытуемый фермент. Смесь выдерживают при 40 С в течение 30 мин. Из этой смеси по ходу реакции отбирают пробы по 1 мл. Каждую отобранную пробу добавляют к 30 мл смеси, состоящей из 0,01 н. раствора серной кислоты и 0,01 н. раствора йод-йодистого калия. Смесь становится пурпурной и через 15 мин определяют коэффициент поглощения этого раствора при длине волны 620 ммк.Величина прироста коэффициента поглощения раствора в процессе протекания ферментативной реакции (в начале реакции и через 30 мин) является показателем ферментативной активности. В этих условиях прирост коэффициента поглощения на 0,01 соответствует 1 единице ферментативной активности.а,6-глюкозидазы, синтезируемые штаммом М. 1 узос 1 е 1 с 11 сцз 11 О 3333, имеют следу- ющие свойства.Оптимум рН 5,5 - 6,0Температурный опти 45 СрН - стабильность 5 - 8469267 Предмет изоопетеци 51 Составитель Л, Минеева Техред Г. Дворина Корректор Т. Гревцова Редактор Т. Пилипенко Заказ 2745/15 Изд, Мв 1406 Тираж 529 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 475Тппогра 11 н 51, пр, Сапунова, 2 Рисовый крахмал +ДекстранПуллулан +ГликогенП р и м е ч а н и е: + - йаличие аквивности-- отсутствие активности.П р и м е р 1. Штамм М. 1 увосЫс(1 сцв1 ГО 3333 выращивают на среде следу 1 оц,егосостава, %:Пептон 1,0Дрожжевой экстракт 0,5К,НРО, 0,1К а С 0,05МЯО 4 7 Н 20 0,050,001Растворимый крахмал 1,4Выращивание осуществляют в колбах пакачалке при 30 С В течение 4 суток.Общая ферментативная активность, определяемая описанным выше способом, составляет 7,4 ед 1 мл, из цих внеклеточная активностьравна б,б ед/мл,П р и м е р 2, Получение фермента из ц 1 гамма М. 1 узос 1 е 1 с 11 сс 1 я 1 РО 3333 и изучение егоПитательну 1 о среду, содержащую, %:Мал ьтоза 1Пеп тон 0,5Дрожжевой экстракт 0,25Мочевица 0,2Мясной экстракт 0,2К 2 Н РО 4 0,1КС 1 0,05МдЯО 4 71-120 0,05засевают 2/, посевной культуры испытуемого штамма,Выращивание осуществляют в специальнойемкости, содержащей 20 л среды, при 30 С вусловиях аэрации и при перемешивании средымешалкой, делающей 200 об/мин.Начял 1 цы 14 рН среды 7,0, Через 3 суток(после око:1 чяция выряп 1 ивация) рН равен8,2.Бактерии отделяют от среды цецтрифугпрованием, промывают один раз водой,0,1/о -цый раствор додецилсульфата натрия в растворе буфера рН 7 суспендируют всоотношении, равном 1:10 по объему в культуральной зкидкости, и проводят автолиз цакачалке при 30 С в течение 48 час. После центрифугирования в надосадочцуюжидкость добавляют сульфат аммония до 0,8 от насыщения.Из выпавшего в результате высаливанцяосадка соответствующим количеством воды экстрагируют фермент, после чего осадок дпялизуют. По окончанию культивирования внутриклеточная ферментативная активность составляет 39,2 ед/мл, внеклеточная - 12 ед/мл.После очистки раствор фермента подвергают исследованию с целью изучения его активности.Оптимальный рН фермента равен 5,5, оптимальная температура - 42"С. При температуг 5 ре выше 50 С фермент быстро теряет актив.ность. То же имеет место при рН среды ниже 5.Характеристика используемого штаммаМ 1 сгососсцв 1 узос(е 1 с 11 сиз 1 ГО 3333 следующая.Кокки диаметром 1,0 - 1,2 мк неподвижные.Грамположительные. На желатине колонии от желтовато-белого до желтого цвета с волнист 1.1 ми краями. Столбик с желатиной цс раз 25;киж ает.На агаре колонии небольшие, укелтоватые,с блеском. На жидкой среде - обрязу 1 от желтоватый осадок. Лакмусовое молоко це коагулирует, реакция слабокислая.0" На картофельном агаре колонии с блеском,лимонно-желтого цвета. Индол не образует.Образует кислоту ца глюкозе, сахарове и манците. На лактозе кислоту не образует. Крахмал це гидролизует. Нитраты до нитритов це-5 восстанавливает.В качестве источника азота использует14 Н 4 Н 2 РО 4, аммоний виццокислый. Рост проявляется по истечении б недель в растворе по Кону. Сапрофит. Аэроб. Оптимальная темпе ратуря 25 С. Способ получения а,6-гл 1 окозидаз путем 15 культивирования их продуцентов ца входнойпитательной среде, содержащей цстсчцики углерода, азота и неорганические соли, отл и ч а ю щи й с я тем, что, с целью повышения выхода а,6-глюкозидаз, в качестве про дуцента используют штамм М 1 сгососсця1 узос 1 с 1 с 11 сиз 1 РО 3333.