Способ получения -1, 6-глюкозидазы

(1 ц 469268 Йоав Советских Социалистических Республик(61) Зависимый от патента (22) Заявлено 01.04.69 (21) 13 (32) Приоритет 01.04.68 (31) 21 51) М. Кл. С 120 13/10 30/28-13 364/68 судврственный комитет 3) Япони ета Минно 53) УДК 5(7.15.08(088,8) Опубликовано 30.04,75. Бюллете Дата опубликования описания 0 ЛЪ 16 оо девам изобре и открытий.09.75 72) Авторы изобретени Иностранцыамору Хирао, Кацуо Мас(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ а,6-ГЛЮКОЗИДА Таб ферментной проспособам получеСпепифичность к субстрат Й-энзимаиз риса, фасоли (бобовкартофеля,ячменя пуллулаиазь из бак терий,б-глюкозидародуцентов на 5 источники уг изомеазы из рожжег Субстр повышение акКрахмалыК-ограниченные декстриныГликогеныДекстраныПуллуланы ачестве пр относящие таммы оЬас 11- Ьгеиз 15 , 1.астивно зи во раз благо- типа: ут быть примене а и других аналоя, таких как глиланы. Обнаружеимы, полученные растений, имеют 30 олученные фе для утилизациных продуктов ены, декстрин что изоамила дрожжевых ку рменты мо и крахмал разложен ы и пуллу зы и К-эн льтур и но,Изобретение относится кмышленности, а именно кния а,б-глюкозидазы.Известен способ получения а зы путем культивирования ее ппитательной среде, содержащейлерода, азота и минеральные соли.Целью изобретения являетсятивности а,6-глюкозидазы.Достигается это тем, что в кдуцентов используют бактерии,к роду 1.ас 1 оЬас 111 цз.Из рода 1.ас 1 оЬас 111 цз используют ш1.ас 1 оЬас 111 цз дауопй АТСС 8289, 1.ас 11 цз р 1 ап 1 агцгп АТСС 8008, 1.ас 1 оЬас 111 цз1 РО 3345, 1.ас 1 оЬас 111 цз Ьгетчз 1 РО 39601 оЬас 111 цз Ъц 1 даг 1 сцз 1 ГО 3533,Известны ферменты, способные селекгидр олизовать а,6-глюкоз иди ые свяглюкозе и отличающиеся один от другогличной ферментативной активностью,даря чему их классифицируют на триизомеразы, пуллуланазы и К-энзимы. очень низкую активность и очень низкие оптимальные температуры (от 20 до 40 С), в то время как пуллуланазы, выделенные из бактериальных сред, имеют относительно высокую активность, причем эта активность в наибольшей степени проявляется при температуре, лишь немного превышающей 45 С. Поэтому, чтобы найти ферменты, которые обладали бы специфичностью по отношению к различным субстратам и были пригодны для использования в тех случаях, когда необходима более высокая специфичность, а также ферменты, которые бы обладали улучшенной теплостойкостью и активностью, были предприняты исследования бактерий, производящих а,6- глюкозидаз ы.65 1;ря этом учитывалось следующее явление; если какой-то штамм вырабатывает фермент, имеющий к,6-глюкозидазнуо активность, то при добавлении к нему раствора, содержащего крахмал и йодистый калий, раствор приобретает синюю окраску.Было отобрано таким образом определенное количество штаммов, относящихся к бактериям вида 1.ас 1 оЬас 111 цз, Эти штаммыкультивировались на культуральных средах, предназначенных для аэробных молочнокислых бактерий. Для культивирования каждого штамма брали 100 мл культуральной жидкости, температуру которой поддерживали на уровне 30 С.Энзиматическую активность определяли, используя супернатант (надосадочная жидкость), полученный в результате центрифугирования культуральной жидкости,1(аждую композицию, состоящую из 5 мл 1 Ъ-ного ожиженного клейкого рисового крахмала, 1 мл 0,5 М уксуснокислого буферного раствора и 1 мл раствора, содержащего испытуемый фермент, выдерживали при температуре 40 С в течение 30 мин.Из реакционного раствора с момента начала реакции ферментолиза и до его завершения отбирали аликвотные пробы объемом 1 мл, Последнюю пробу отбирали спустя 30 мин после начала реакции. Каждую отобранную из раствора пробу выливали в смесь 30 мл 0,01 н. раствора серной кислоты и 0,01 н. раствора подйодистого калия. Смесь становилась пурпурной, и спустя 15 мин определяли ее коэффициент экстинкции (т, е. поглощения) при длине волны видимого света 620 ммк. Величина прироста коэффициента экстинкции реакционного раствора, полученная в результате измерения в начале реакции ферментолиза (при нулевом времени) и спустя 30 мин, рассматривалась в качестве критерия ферментативной активности.В этих условиях абсолютное увеличение (прирост) коэффициента экстинкции на 0,01 соответствует единице энзиматической активности.Из бактериальных штаммов, исследованных на активность по описанной выше методике, применялись штаммы, принадлежащие к видам, которые продуцируют больше ферментов во внешней среде, окружающей клетки, чем в самих клетках, в частности 1 ас 1 оЬас 111 цз р 1 ап 1 агцт. Эти штаммы культивировались в специальных банках и затем очищались для дальнейшего исследования ихэнзиматическото поведения и специфичности по отношению к различным субстратам.Степень размножения бактерий в культуральных средах определялась по изменению коэффициента экстинкции каждой культуральной жидкости, разбавленной в 10 раз, причем коэффициент экстинкции измерялся при длине волны 660 ммк. За изменением рН культуральной жидкости следили при помощи стеклянных электродов. 5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 бО Лэробные штаммы вида 1 ас 1 оЬас 111 цз куль тивировались в специальных банках в условиях аэрации при 30 С в течение 3 дней. Штаммы подвергались очистке посредством автолиза культуральных сред, высаливания из раствора сульфатом аммония и двукратного диализа супернатанта.Энзимы бактерий вида 1.ас 1 оЬас 111 цз имеют более высокую оптимальную температуру ( (50 С) и более ,высокую теплостойкость. Отсюда можно сделать вывод, что энзимы бактериальных культур вида 1.ас 1 оЬас 111 цз в большей степени приспособлены для промышленного использования. Оптимальная область рН для энзимов вида 1.ас 1 оЬас 111 цз равна 5,5, но они остаются активными и при относительно низких значениях рН.Специфичность ферментов по отношению к различным субстратам оценивалась следующим образом: субстрат подвергали воздействию р-амилазы, являющейся одним из энзимов группы а,6-глюкозидазы, и затем определяли скорость энзиматического разложения субстрата. В качестве субстратов для этой цели использовали картофельный крахмал, рисовый крахмал, р-предельный декстрин, гликоген, декстран и пуллулан. Скорость разложения пуллулана оценивалась по скорости накопления в реакционной среде мальто-триозы, которая получается в результате ферментативного гидролиза пуллулана, а скорость разложения других субстратов оценивалась по тому, с какой скоростью в реакционной среде накапливалась мальтоза - продукт ферментативного гидролиза этих субстратов.Указанные три типа ферментов обладают постоянной активностью по отношению к 1,6- связям в крахмальных системах, но все эти три типа ферментов являются практически неактивными по отношению к декстрану,Ферменты бактериальных штаммов вида 1.ас 1 оЬас 111 цз по своим энзиматическим свойствам относительно а,6-глюкозидов очень похожи на пуллуланазы вида АегоЬас 1 ег.П р и м е р 1. Производство а,6-глюкозидаз бактериальными культурами.В результате йод-крахмальной реакции находят штаммы бактерий, принадлежащих к виду 1.ас 1 оЬас 111 цз.Эти штаммы культивируют в колбах, а затем испытывают на энзиматическую активность.10 мл культуральной среды, имеющей состав, указанный ниже, засевают с помощью небольшой платиновой ложечки испытуемым штаммом, после чего его культивируют 4 дня при температуре 30 С. Аэробные бактерии культивируют при перемешивании и вибрации питательной среды, в то время как молочнокислые бактерии культивируют в стационарных условиях. Состав культуральной среды (оо) для бактерий:469268 аэробных молочно- кислых 1,000 1,000 ПептонДрожжевойэкстрактКгНРОМаС 1 0,500 0,100 0,050 0,500 0.100 0,050 Энзиматическая активность, ед./мл внеклеточнаявнутриИспытуемый штамм общая 1.ас 1 оЬас 11 цв Ьгет(в 4,7 1 РО 8345(.ас 1 оЬас 11 цв Ьцдаг 1 сцв 3,91.ас 1 оЬас 1 цз дауопИ АТСС 82891,ас 1 оЬасйцв рап 1 агцпт 3,8 АТСС 8008 2,1 0,3 1,3 0 3,5 1,5 2,7 3,6 2,0 3,9 З,б 3,0 49 2,0 7,4 Данные о энзиматической активности и специфичности изоамилазы по отношению и различным субстратам предстаглены в табл. 3.Таблица 3 Свойства изоамилазы Показатель из бактерий вида 1.ас 1 оЬас 11 цврастительногопроисхождения из дрожжей 5,0 - 5,5 40.45 Температура дезактивации, ОССпецифичность к субстратам;картофельный крахмалрисовый крахмал8-предельный декстриндекстранпуллулаигликоген 11 р и м е р 2. Получение энзимов из 1.ас 1 оЬас 111 цз р 1 ап 1 агшп и изучение их свойств.В этом примере используют культуральную среду того же состава, что и в примере 1. Культивирование бактерий в каждом случае осуществляют в 1 л культуральной жидкости при 30 С и перемешивании в течение 3 дней. Полчченьт следующие результаты: прирост рН 0,95 - 4,0, активность внеклеточная 16. внутриклеточная 17, общая 33.Раствор фермента штамма 1 ас 1 оЬаст 11 п р 1 апагцгп получают насыщением с пернатанта (надосадочнотт культура чьттотт жидкости) сульфатом аммония до по,чченття 0.8 насытценного раствора, Выпавший осадок отделяют пентрифугированием, растворяют в воче и диализуют против волы в течение одного дня.Раствор 1.ас 1 оЪаст 11 пз максимальнчю активность проявляет при значениях рН от 5 до 6.5. При определении оптимальной темттератм - ры установлено, что раствор 1.ас 1 оЬас 111 цз не теряет,. активности . вп,тоть до температуры 55 С, что указывает на .высокую теплостойМАМБО 7 Н.О 0,050 0,050 Ре 50 чНзО 0,001 0.001 Разжиженныйкрахмал 1,400 0,700Мальтоза - 0,500Данные, полученные в результате культивирования, представлены в табл, 2Таблиц а 2 10 кость этик ферментов по сравненпо с другиПри определении специфичности исследуемьтк Ферментов по отношению к различным субстратам получают и подвергают очистке 15 ряч субстратов, чистота которых устанавливается при помощи бумажной хроматографии.В число этик субстратоз входят: крахмал картофельный и рисовый, р-предельньттт декстрин, чекстпан, глпкоген и пуллулан.20 Эти субстраты подвергают одновременномувоздействию какого-либо одного из испытуемых энзимов и р-атиилазьт, причем полученные результаты выражают путем опенки скорости накопления в реакционной среде мальтоз 25 цлн мальто-тпиоз. Ферметтттт оактепиз,чьныккультур вила Т.ас 1 о 1 аст 11 ттч не об,чалаот способностью различать этот субстрат. В табл. 4 приведены данные, показывающие 30 процентное содержание в реакционной смесинизкомолекулярных сахаров-мальтозы (мальто-триозьт), рассчитанное на общее содержание сахаров в реакционной смеси.,-Ами- л Субстрат энзима лаза Крахмал картофельныйКрахмал рисовый 11,5 67,8(87,6) Пуллулан 32,4 Реакционная смесь (мл);Субстрат (1%) 50 Ацетатный буфер (0,5 М, рН 6,0) 1 ф-Амилаза (5 единиц) 1 Цуллуланаз а 1,Общее содержание сахаров оценивается при помощи антпопного метода, а концентрация в реакционной смеси низких сахаров оппеделяется по методу Сомоги - Нельсона. Образцы р-предельного декстрина, 8-, с .чазы, мальтозы. тгллланя и мальто-триозы. котопые используют при ппопеденпп ис стьтапий, полгцяют в лаборатории, я их цистотя устачяв.чивается при помогци бумажной хроматографии. Хяпактепистики сптямои 1 асФоЬясцз 1.ас 1 оЬяспз ряопЙ АТСС 8289 с 1.ас 1 оЬяс 11 цз 1 еггпеп 1 цгп АТСС 828 о)Палочки размером от 0.5,чо 1,0 мк, от 3.0 до 15,0 мк в паре или в цепочке. Неподвижньь Грамположительны.Опгапическая среда. Ня спеде, соченкагцей дпокжевой экстракт-глюкозч - желатин, разжикение желатина не наблюдается.Агап. 1 о,чонии плоские, кольцевые, небольшие, прозрачные.На косом агаре наблюдается незначительный рост,На жидкой среде. Бульон местный, осветляется по истечении нескольких дней.Молоко не свертывает или свертывает слегка.Восстанав,чивяет чакмчс, метиленовьтй голубой, индигокармин, тиосльсЬат натрия. Из Уя 50 з восстанавливает НэЯ. Образует кис.чоту из глюкозы, сЬпъктозы, мальтозы. сахарозы, ляктозьт, маннозы, галактозы, расЬфинозы.Арабинозу, рамнозу, сорбит, маннит, инолит, декстрин, крахмал и си,чицин сбражизает.При бпожении альдогексоз образу ет молочную кислот (оптически недеятельна), кс сную кислоту, этиловый спирт и двуокись углерода. 10 15 20 25 30 35 45 50 55 60 65 При брожении фруктозы образуется машНитраты в нитриты не восстанавливае;. Микроаэрофильпые. Температуры: оптимальная 41 - 42 С, минимальная с 5 - -.8 С, максимальная 48 - 50 С. 1.ас 1 оЬас 111 цз р 1 ап 1 агцгп АТСС 8008 Палочки с закругленными краями размером 07 - 1,0 и 30 - 80 мк, отдельные или в виде коротких пс"очек, Граммоложптсльньь Прп посеве уколом на яелатпп, дронскс-.,ой экстракт, глюкоза; рост нитеппдньсй, рязкижения не наблюдается,На косом агаре незначительный рост, На жидкой среде образует муть, осветляется по истечении нескольких дней.Лакмусовое молоко; кислое, коагулированное.Образует кислоту из глюкозы, фруктозы, маннозы, галактозы, арабинозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, рафс 1 инозы, салицина, и в меньшей степени, из сорбита, маннитя, декстрина, глицерина и ксилозы. Рамнозу, крах. мал и инсулин не сбраживает,Ппи брожении гексозосахаров обпазчет молочнсю кислотч (оптически недеятельна только с небольшими количествами уксусной кислоты и двуокиси углерода.Из пентоз обпазчет чксусные и молочные кислоты. Нитпитьт не восстанавливает в нитпяты в обьсчном бсльоне. Микпоаэрофильные Температура пазвития 10 в С, оптимальная 30 С.Солевыносливость: растет на среде, содепяяпсей 5,5% соли,1 ассоЬасцз Ьгессз 1 РО 3345 .ас 1 оЬас 1 цз Ьгессз 11."О 3960 Палочки размером 0,7 - 1,0 и 2,0 - 4,0 мк с закптсгленными кпаями, встречаются по очной и в виде коротких цепочек, ре,чко в длинных нитях, котопые могут иметь сЬорму гранул.Нпотвссптц Гпяммн,чожите,чьны.желатин не разжижает.Ня косом агапе незначительный рост.На жидкой среде обпаз ет м.ть, осветляется по истецении ческо.чьких дней.Из молока образует кис.чоту. Не пязрушает казеин.В кяцестве источника г,чепочя использует диктат кальция. Обпяз ет кислотч из арабичозы. ксичозьь глюко;ы. срртктозы, га,чактозы и мя.чьтозы.Сячипин, мяннпт, глицерин, пямнозч, декстпин, инслин и кпахма,ч редко сбпаживяет.При брожении яльдогексоз обпязет мо,чоцную кислоту (оптически недеятельна). сксуснчю кис,чотч, этиловый спипт и двчокись чглепода. При бпояении фруктозы образуется маннит.Из пектоз восстанавливает уксуснчо и мо.чоцнтсю т слота. Темпепатура пазвития 15 - 38 С, оптимальная 30 С.10 Предмет изобретения Составитель Г, СубботинаРедактор Н. Спиридонова Текред Г. Дворина Корректор Е. Рогайлина Заказ 1820/5 Изд. Хо 1475 Тираж 529 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 45Типография, пр. Сапунова, 2 Тонкие палочки с закругленными концами в виде цепочек. Неподвижны, Граммположительны.Желатин и молочную сыворотку не разжижает.Колонии плоские, желтовато-белые, диаметром 2 - 3 мм. Агар и молочная сыворотка; колонии кольцевые, асимметричные.Молоко коагулирует при температуре 37 С. Газа не образует. Казеин не разлагает. На картофеле не растет. Индола не образует. Сбраживает глюкозу, лактозу и галактозу. Не сбраживает ксилозу, арабинозу, сорбозу, рамнозу, дульцит, маннит, декстрин, инулин и крахмал,Сбраживает сахарозу и мальтозу. Образует высокую кислотность в молоке. Молочная кислота оптически недеятельна. Нитраты не восстанавливает в нитриты. Микроаэрофильны. Оптимальная температура развития 45 - 50 С, минимальная - 22 С. 1. Способ получения и,6-глюкозидазы путем культивирования ее продуцентов на пита тельной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, отличающ и й с я тем, что, с целью повышения активности а,6-глюкозидазы, в качестве продуцентов используют бактерии, относящиеся к роду 10 1.ас 1 оЬасИ 1 цз.2. Способ по п. 1, отличающийся тем,что из рода 1.ас 1 оЬас 1 Ицз используют штамм 1.ас 1 оЬасИ 1 цз с ауопй АТСС 8289.3. Способ по п. 1, отличающийся тем, 15 что из рода 1.ас 1 оЬасИ 1 цз используют штамм1 ас 1 оЬас 1 Ицз р 1 ап 1 агцгп АТСС 8008.4. Способ по п. 1, отличающийся тем,что из рода 1.ас 1 оЬас 111 цз используют штамм 1.ас 1 оЬас 111 цз Ьгеиз 11.О 3345.20 5, Способ по п, 1, отличающийся тем,что из рода 1 ас 1 оЬас 1 Ицз используют штамм 1.ас 1 оЬас 1 Ицз Ьгеиз 1 ГО 3960.6. Способ по п. 1, отличающийся тем,что из рода 1.ас 1 оЬасИ 1 цз используют штамм 25 1.ас 1 оЬас 1 Ицз Ьц 1 даг 1 сцз 11 О 3533.