Способ очистки -аспарагиназы

РдИЛТи;онбл;о гс,. ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК П А ТЕ НТУ ц 443 Б Союз Советских Социалистических РеспублнкЗависимый от патент М. Кл. С 07 д 7/О 2) Заявлено 18.12.68 (21) 1290716,28-13/ 138986923-4.68 (31 сударственный комнте вета Министров СССР 33) Ф нь34 о 15.09.74. Бюлл 3) УЛК 547.964.4.05(088.8) ликов по делам изобретений н открытий) Авторы изобретени 11 ностранн ы с Бауер, Вильфрид ьфред Аренс и Экк(ФРГ) Иностранная фирма Байер АГ(71) Заявитель Ч И СТКИ 1.-АС ПАРА ГИ НА 54) СПО оИзобретение относится к ферментной промышленности и представляет собой способ очистки 1,-аспарагиназы.Известен способ выделения ферментов из сыворотки или плазмы при действии полиэтиленгликоля.Предлагается способ, согласно которому перед осаждением полиэтиленгликолем к водным растворам Л-аспарагиназы добавляют амиды, например мочевину, которые разлагают водородные мостиковые связи. Было найдено, что чистоту 1,-аспарагиназы можно повысить, если осаждать фермент у изоэлектрической точки. В предлагаемом способе достигается такаястепень чистоты 1.-аспарагиназы, которая досих пор была невозможна в технических масштабах,Кроме того, растворяющее действие, например, мочевины позволяет работать с воднымрастворами 1,-аспарагиназы повышенной концентрации, что упрощает технологический процесс.П р и м е р 1. 5 кг сырой аспарагиназы подают при комнатной температуре в 40 л дистиллированной воды. Значение рН медленно о разующегося раствора устанавливают при помощи 1,5 л 1 н, ХаОН на уровне 8,5 - 8,9, Затем добавляют мочевину до концентрации приблизительно 3 моль/л. Температура раствора 5 снижается при этом приблизительно на 10 С.Размешивают еще 1 ч, а потом выдерживают образующийся раствор в течение 16 - 24 ч прп температуре 4 С. По истечении этого времени осаждают фракцшо 1 путем добавления 25 - 0 30 л 504-ного раствора полнэтилснглнколя,затем фракцию 1 удаляют. Фракцию 11 осаждают с добавлением еще 15 л 505-ного раствора полиэтиленгликоля. Фракция 11 получает главную активность, Путем добавления еще 5 15 л раствора полиэтиленгликоля к остатку отфракции 11 получают фракцию 111, которая имеет 20 - 25% активности сырой аспарагиназы. Фракцию 11 подают приблизительно в 2,5 л дистиллированной воды. В результате 20 добавления 250 мл 50 ц,-ного раствора полиэтиленгликоля осаждается фракция 1 а, а путем добавления еще 250 мл раствора полиэтиленгликоля осаждается фракция 11 а. Аналогичным способом получают фракции 111 а 25 и 1 Ч а. Достигаемые при таком фракционировании степени чистоты н выходы приведены ниже в таблице.Единицы/мгод о(, ферментативной активности, из расчета на исходную сырую аспарагиназу(одноиинутные единицы) фракция 0,3 8,0 31,2 11,5 4,6 а Па П 1 а 1 Ча Ча 1,6 8,1 23,0 16,2 18,9 19,4100,0164,0 74,0 25,0 55,6 Итого 60 П р и м е р 2. Работают аналогично примеру 1, но повышают концентрацию мочевины приблизительно до 6 моль/л. После этого раствор выдерживают только 2 ч, Выходы почти совпадают с выходами примера 1.П р и м е р 3, Работают аналогично примеру 1, но вместо мочевины добавляют гидрохлорид гу анидина до концентрации приблизительно 2 моль/л, Раствор выдерживают 2 ч. Выходы соответствуют выходам примера 1.Оса ждение ведется из изоэлектричес кой точки.П р и м е р 4. 100 г Е-аспарагиназы с удельной активностью приблизительно 100 Ь/мг протеина растворяют в 1000 см дистиллированной воды при комнатной температуре, Во время растворения устанавливают значение рН при помощи 1 н, аОН на уровне 8,5 - 8,9. Нерастворимый остаток удаляют в течение 10 мии путем цеитрифугироваиия при 6000 об/мин, Значение рН оставшегося осветленного раствора доводят в ледяной ванне медленно до 7 - 8, Образующийся маслянистый осадок удаляют в течение 25 мин путем центрифугирования при 6000 об/мии, Остающийся после центрифугирования осветленный раствор доводят при помощи 1 и. НС 1 до рН 5,2. Потом последовательно подают по 25 мл 50%-ного раствора полиэтиленгликоля и каждый раз центрифугируют в течение 10 мин при 6000 об/мин. Таким образом получают приблизительно 5 - б фракций, причем фракции 111 - Ч имеют главную активность с самой высокой удельной активностью.Выход 60 - (0%.П р и м е р 5. Работают аналогично примеру 4, но вместо полиэтиленгликоля четырьмя порциями добавляют холодный ацетон до 20% объема раствора.Выход соответствует выходам примера 4, П р и м е р б. Работают аналогично примеру 4, но вместо полиэтиленгликоля пятью порциями добавляют этиловый спирт до 20% объема раствора. Выходы соответствуют выходам примера 4,П р и и е р 7. 100 г Е-аспарагиназы с удельной активностью 140 У/лг протеина растворяют в 500 мл воды; значение рН раствора устанавливают при помощи 1 н. аОН иа 5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 уровне 8,5. 1-1 ерастворившийся материал удаляют в течение 15 мин путем центрифугировалия при 6000 об/мин. Йначсние рН осветленного раствора устанавливают при 4 С и при помощи 1 и. НС 1, равным 6,8, а образующийся при этом осадок удаляют путем центрифугирования, Остающийся после центрифугирования раствор при помощи 1 и, НС медленно доводят до рН 5,.0 - 5,1 и выдерживают несколько часов при температуре 4 С, Образующийся при этом осадок удаляют путем центрифугироваиия. Этот осадок содержит Е-аспарагиназу с выходом 60 - 80% исходной активности и с максимальной удельной активностью до 190 У/иг протеина.П р и м е р 8. 200 г сырой аспарагиназы с активностью 97 Е/мг растворяют в 4000 мл гликоколевого буфера при рН 8,5 и в течение 30 мин нагревают горпиями до 60"С. При этом ко а гул ируется неактивный протеин, а фермент остается по-прежнему в растворенном состоянии. Исходную смесь центрифугируют при 6000 об/мии и фракиионируют при помощи ацетона. Ооразующийся в результате добавления 40 - 45% ацетона осадок содержит 16,4 г Е-аспарагиназы. Ои имеет активность 863 Е/,иг.9,3 г э.ой концентрированной аспарагииазы растворяют в 190 мл раствора, содержащего 3 моль мочсвииы иа 1 и, устанавливают при помощи раствора едкого патра значение рН 8,5 и фракциоиируют при помощи полиэтиленгликоля (50% -иый водный раствор), Получаемую после добавления 22 - 30 мл фракцию выделяют и обрабатывают обычным способом. Выход 2,1 г, активность 3130 Е/мг. Раствор из 4,0 г этой пробы в 40 мл дважды дистиллированной воды доводят при помощи 1 и. НС 1 до рН 5,2 и фракционируют при помощи раствора полиэтиленгликоля. Образующийся после добавления 12,5 - 15 мл осадок удаляют после 20 мин стояния при комнатной температуре путем центрифугироваиия и после 2 ч стояния под ацетоном промывают еще ацетоном,Выход 1,2 г, активность 6110 Е/мг. Осадок состоит из кристаллов в виде плоских призм, окрашен в коричневый цвет при 225 С, спекается, начиная с 260 С, вспеиивается, начиная с 270 С, и полностью разлагается, начиная с 274 С.Полученные таким образом кристаллы перекристаллизовывают из водных растворов путем добавления органических растворителей, например ацетона или спирта, или путем добавления полиэтиленгликоля. Предмет изобретенияСпособ очистки (.-аспарагиназы из водных растворов путем осаждения полиэтилеигликолем, отл и ч а ю щи й с я тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, к исходному раствору Е-аспарагиназы добавляют амид, например мочевину.