421200

(61) Зависимый от патента(22) Заявлено 04.05.72 (21) 1781030/31-16 (32) Приоритет 05.05.71 (31) Р 2122294.6 51) М. Кл. С 12 г 1 13/1 Государственный комитеСовета Министров СССРоо делам изобретенийи открытий ФР Опубликовано 25,03.74, Бюллетень1Дата опубликования описания 14,08.74 577.155,38(72) Авторы изобретени Иностранцы юнтер Хольц, Иоганна Грамзалль (ФРГ Михаель Нельбек-Хохштеттер (Австрия) и Ханс Ульрих Бергмайер (ФРГ) Иностранная фирма Берингер Маннхайм ГмбХ71) Заявите 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА, КАТАЛИЗИР ПРЕВРАЩЕНИЕ КРЕАТИНИНА И КРЕАТИН Е и катов из катав крену по- ложипочвы, , фосл-инозитгликоллятпеларгона олучения фермент щение креатинипа в аммиак и мочев ирования граммп 5, выделенных из ей креатинин, ага ел иоти- адипат чным и-оксибензоат получение ащение кре- атализируюркозин и мофенилацетатвалинаргинин6-аминовалетриптофанбетаингиппуратацетампдбензи тамии мент ся тем, что в уют культур ч и Репс шпг реды глюкозуы. 20 а.личество х согласоследние добавкой микроорвенно на содержит углерода,щилл ить ко няемы ах, п но с Оба ущест рая чнпк Изобретение относится к медицинесается получения ферментных препармикроорганизмов.Известен способ плизирующего превраатин и креатининасредством культивтельных бактерий Хна среде, содержащфаты.Целью изобретения являетсяфермента, катализирующего превратинина в креатин, и фермента, кщего превращение креатина в сачевину,Поставленная цель достигаеткачестве продуцента использА 1 са 1 депез зрес. %5. 51400 ил%5, 90001 и вводят в состав сили глицерин, а также витамин Для получения креатинина-амидогидролазы и креатина-амидиогидролазы применяются микроорганизмы Аса 11 депез зрес. %Ь. 51400 или Репс 1 шгп 90001.А 1 са 1 депез зрес. %5. 51400 характеризуется определенно оксидированными грамотрицагельными короткими палочками со жгутиками. Зародыши имеют слабую положительную реакцию на оксидазу, подщелачивают лакмусовое молоко и способны к денитрификации Культура обладает следующими свойствами; Рост при 4Рост при 41 СРазжижениеныРасщепление тринаРеакция с яжелткомОбразование иФерментацияАрабиноза +Глюкоза +Мальтоза +Целлобиоза +Трегалоза +2-кетоглюконатМаппнт +%5 90001 - грибок вида пен Чтобы соответственно увеличтребуемых ферментов в приме 5 но изобретеншо микроорганизмкультивируются преимуществен креатипина в среду для роста, ганизма выращиваются преим одной питательной среде, кото 0 глюкозу или глицерин как исто421200 Предмет изобретения 40 45 50 Составитель С, ШеневаТехред А. Камышникова Корректор М. Лейзерман Редактор Д. Пинчук Заказ 1813/13 Изд. Ио 664 Тираж 456 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам, изобретений, и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Сапунова, 2 Типографии, пр,креатинин и соли и витамины в известном вмикробиологии количестве и составе. Особенно подходящая питательная среда имеет следующий состав:0,5 вес. % глюкозы или глицерина,0,5 вес. % креатинина,0,08 вес. % сульфата аммония,0,02 вес. /, магнийсульфатгидрата,ничтожные количества сульфата железа, хлорида кальция, сульфата марганца,0,05 вес. % дрожжевого экстракта,никотиновой кислоты,тиамин-и-аминобензойнойкислоты,витамин Вв (по 1 мг),0,1 мг биотина,который растворяют в 0,1 М буферном растворе с фосфатом калия рН 6 (грибок) или рН (А 1 саИдепез) .Штамм микроорганизмов получают обычным образом в пробирке с косым агаром добавкой 2% агара в соответствующую питательную среду, к которой еще добавляют 5 мл/л 0,05%-.ного раствора брома-тимола синего. В предпочитаемых условиях роста окраска этого индикатора у грибка через 4 - 6 дней, а у бактерий через 2 - 3 дня отчетливо переходит в щелочную область, что обусловлено расщеплением креатинина-креатина. Потребляющие креатинин микроорганизмы, которые не производят расщепления по вышеназванной схеме обмена веществ с перечисленными ферментами, не имеют этого,подщелачивания.П р и м е р 1. 2 л питательной среды, содержащей 1 вес. /, глюкозы, 0,5 вес. /о креати- нина, 0 08 вес. /о сульфата аммония, 0,02 вес. % гептагидрата сульфата магния, 0,05 вес, % дрожжевого экстракта, по 1 мг никотиновой кислоты, тиамин-и-аминобензойной кислоты и витамина Рв, 0,1 мг биотина, сульфата железа, хлорида кальция и сульфата марганца в ничтожных количествах в О, М буферного раствора фосфата калия с рН 6 засевают в качалочной колбе 200 мл предварительно выращенной (48 час) культуры Реп 1 с 11 Ицт 90001 и культивируют 4 дня в аппарате для встряхивания. Содержание креати- нина снижается с 0,5 до,почти 0,1%, а глюкоза к этому моменту уже израсходована, величина рН,повышается с 7,5 до 8. 5 10 15 20 25 Зо 35 4,Получают 3 - 4 г %5 90001 сухого веса на 1 л питательного раствора с 45 - 60 МЕ/г сухого веса креатинин-амидогидролазы.П р и м е р 2. В соответствующем сосуде для разведения культуры культивируют 15 л описанной в примере 1 среды с 1,5 л предварительно выращенной культуры А 1 саИдепез зрес. уу 3 51400 при интенсивной аэрации. При этом в течение всего периода культивирования поддерживают постоянную величину рН 7. Непрерывно следят за содержанием креати- нина и глюкозы. Расход креатинина происходит, главным образом, во второй трети рабочей фазы, в то время как глюкоза расщепляется сначала. Культуру выдерживают при 30 С, Через 35 час можно собрать 1,5 г/л сухого вещества бактерий,П р и ме р 3. Культивируется как описано в примере 2 А 1 саИдепез зрес, 51400 в рабочем объеме 60 л. Как только достигается требуемая стадия роста, начинают подавать в сосуд для культивирования свежую питательную среду и в одинаковой степени отбирать из сосуда для культивирования выращенный питательный раствор. При этом норма разбавления (скорость течения/рабочий объем) составляет 0,13 - 0,18, преимущественно 0,16, За 1 час пропускают 500 л воздуха. При непрерывном культивировании получают выход 3 - 5 г/л сухого вещества бактерий со специфической активностью, которую определяют по описанному в примере 2 периодическому методу.А 1 саИ 1 зепез зрес. уу 3 51400 хорошо пригодна для непрерывного культивирования. Способ получения фермента, катализирующего превращение креатинина и креатина, путем выращивания культуры-,продуцента на среде, содержащей креатинин и минеральные соли, отличающийся тем, что, с целью получения фермента, катализирующего превращение креатинина в креатин, и фермента, катализирующего превращение креатина в саркозин н мочевину, в качестве продуцента используют культуру. А 1 саИдепес зрес. %5 51400 или Регбс 11 Ицгп %Ь 90001 и вводят в состав среды глюкозу или глицерин, а также витамины.