Ингибитор фермента моноаминооксидазы

СОЮЗ СО 8 ЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 19) (1 И 25 А ИЗ САН ИЯ ЛЬСТВУ АВТОРСК 415213/31-11.02.885.07.90. Бкл(7 (5 (5 яцкии на А.И.,З,П, Фарма ния ниалами ксикология ческие свойбитора монослогия и ток 639-640. МОНОАМИНООКтся к биолоениям, а имеиолам общей Н.,СН.,ОН, гпе з эе. биоло е тве ингибисльзуют эа именно кщей форму эт анолы, сися в одной к коммерчнений.Изоб ся при ение иллюс ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИПРИ ГКНТ СССР версит т2) З,П.Гуреева и М.К.3) 577.15 (088.8)6) Гилев А, ТерехиТарасова Э.И., Гуреевакологические исследовада, - Фармакология и то1967, У 3, с, 328-331.Гуреева З,П, Специфиства ниаламида как ингиаминооксидаэы, - Фармаксикслогия, 1981, У 5, с(57) Изобретение относгически активным соедино к бенэилиденаминоэтформулы (Х) С Н СН = Н Изобретение относится и активным соединениям, ензилиденаминоэтанолам ы СН=СН (НХ где Х - М - 10 (1); и - ИО (11);и - Ф ( СН )(111 )Цель изобретения - выявление соединения ряда оснований Шиффа, имеющего И -р -оксиэтильную группу и обладающего повышеннои ингибирующей активностью по отношении к моноаминоокГ 51)5 С 07 С 251/02,Х - ш - НО (1) ф Р - 110(11)Р И(СНэ) (111), в качестве ингибиторов фермента моноаминооксидазы. Цель изобретения - выявление соединения ряда оснований Шиффа, имеющего 1 в -оксиэтильную группу и обладающего повышенной ингибирующей активностью по отношению к моноаминооксидазе и низкой токсичностью. На разных видах животных (белые мыши, крысы, бык,глухарь) показано, что соединения (1) (111) являются эффективными ингибиторами деэаминирования серотонина и бензиламина в печени и мозге в опытах и что и 1 и чего. Эффективность ингибирования достигает 852 при концентрации 13 мкМ. На примере препарата (1) показано, что ЛД составляетЕо1563 мг/кг, т. е. препарат является малотоксичным, Соединения могут найти применение в медицине в качестве антидепр ес с актов 6 табл. кой токсичностью. В качеора моноаминоокеидазы исещенные Б-бензилиденаминотез которых осуществляеттадии с использованиемдоступных исходных соедир ами,П р и м е р 1, 2-(ус-Нитробензилиден)аминоэтанол (1).Получен кипячением 30,5 гСерия 1, Берут свежий или свежезамороженный кусочек ткани печенибыка, промывают ее холодной дистиплированной водой от крови, просушивают между листами фильтровальной бумаги, отванивают на технических весахнавеску, например 5 г, которую затемпомещают в чашку Петри, стоящую .нальду, измельчают навеску ножницамии кусочки ткани печени помещают вохлаждаемый льдом гомогенизатор типаМР, в который, кроме того, доливают двойное количество 0,2 М фосфатного буфера рН 7,4, т.е. 10 мл, Гомогенизируют печень в фосфатномбуфере 1,5 мин на холоду. Полученныйгомогенат разливают в 3 круглодонныесклянки на 50 мл. Одна склянка служитв качестве холостой, вторая - контрольной, третья - опытной, В каждуюсклянку приливают по 1 мл Фосфатно-.го буфера и по 1 мп гомогената.Крометого, в контрольную и опытную склянки добавляют субстрат - серотонинв виде креатинин сульфата 3,2 мг илибензиламин гидрохпорид 5,7 мг. Вопытную склянку в отличие от конт-ральной добавляют ингибитор, растворкоторого готовят следующим образом:2,5 мг препарата - ингибитор а (Х ),(11) или (111) растворяют в 1 млФосфатного буфера, берут 0,1 мп этого раствора и помещают в пробы,названные выше опытными. Для полученияконцентрации ингибитора в 10 разменьшей навеску ингибитора на аналитических весах 2,5 мг растворяют в10 мп фосфатного буфера, В холостуюи контрольную пробы добавляют Фосфатвый буфер в количестве 0,1 мп длявыравнивания объемов так, что конечный объем в пробах составляет 2,1 мп.Все склянки помещают в аппаратВарбурга, где они встряхиваются при38 С в течение 50 мин, Затем белкив пробах осаждают 2 мп 247.-ной хлорной кислоты, центрифугируют и 0,2 млнадосадочной яядкости используют дляанализа аммиака по методу Конвея.Изкаждой пробы переносят по 02 млсупернатанта во внешнюю часть трехчашек Конвея,Серия 2. После приливания 0,2 млсупернатанта во внешнюю часть. чашекКонвея в противоположный конец наливают 107-ный раствор едкого натрия,В центральной части чашек Конвеязаранее наливают 0,001 н, раствор 3 1578125тор) в 200 мл толуола с азеотропнойотгонкой воды. Кристаллическую массу,образующуюся по охлаждении реакционной смеси, перекристаплизовывают изтолуола. Получают 80,0 г (82,0)соединения (1),Желтоватые кристаллы с т,пл, 6971 С.Найдено,7: С .55,30; 55,41; Н 5,01; 105,23; Б 14,22 14,38.С,Н Б,О,.Вычислено,%: С 55,67; Н 5,19;Б 14,42.ИК-спектр, 1,см -: 34 (-ОН связ)151660 (С = Б), 1360 (снм. БО).П р и м е р 2. 2-(и-Нитробензилиден )аминоэтанол (11 ).Получен аналогично примеру 1 из11,0 г (0,18 моль) моноэтаноламина, 2027,2 г (0,18 моль) и-нитробензапьдегида, 0,5 г и-толуолсульфокиспоты в100 мл толуола. Выход 18,0 г (51,5%).Желтоватые-игольчатые кристаллыс т.пл . 80 - 82 С. 25Найдено,%: С 55,55; 55,07; Н 5,12;5,08; Б 14,30; 14,35.СзН 1 оБОэВычислено,7: С 55,67; Н 5,19;Б 1442.30ПМР-спектр, с, м.д.: 2,60 (1 Н,ОН); 3,86 т (2 Н, СН Б); 3,98 т(1 Н, СН = Б).П р и м е р 4. Исследование прейа ратов (1), (11), (111) на окислительное дезаминирование серотонина ибензиламина в гомогенатах печеникрупного рогатого скота в опытах.10 30 35 40 45 50 55 5 15 соляной кислоты. Чашки закрывают герметически стеклом, перемешивают содержимое из внешней части и оставляют до утра следующего дня: на 18 ч, при комнатной температуре. Потом открывают чашки и титруют остаток соляной кислоты, не связавшийся с аммиаком, 0,001 н. раствором едкого натрия в присутствии смешанного ин" , дикатора: на 2 части 0,17-ного раствора метиленового красного 1 часть О, 1 Е-ного раствора метиленового синего. Расчет производят по формуле: (а - в) 10, где а - количество едкого натрия, пошедшего на титрование холостой пробы, мп; в - количество едкого натрия, пошедшего на титрование контрольной или опытной проб,мп, Разницу умножают на 10, чтобы учесть разведение и пересчитывают на 100 мг сухого гомогената ткани печени.Чтобы получить сухой гомогенат ткани органа, в предварительно взвешенный бюкс помещают 1 мп гомогената, приготовленного так, как описано вьппе. Незакрытый бюкс ставят в сушильный шкаф и высушивают гомогенатпри 80 С до постоянного веса. Сухой ткани в бюксе оказывается 50 80 мг, но результат, полученный после титрования в мкмоль аммиака рассчитывают на 100 мг веса сухого гомог ената.В контрольной пробе с субстратом серотонином аммиака выделилось 9,8 мкмопь на 100 мг сухого гомогената ткани печени быка, а в опытнойпробе (с ингибитором) в присутст-. вии препарата (1) значительно меньше: 4,9 мкмоль аммиака на 100 мг сухого гомогената ткани, Процент ингибирования, следовательно, составляет 502 (см. табл.1,.Аналогично проведены опыты с препаратами Би Б. Судя по снижению количества выделившегося аммиака в опытных пробах по сравнению с контрольными ингибирование дезаминирования серотонина высокое 43,9 92,97Если вместо серотонина в аналогичных опытах берется субстрат бензиламин, то при добавлении препаратов (1), (11) и (111) в опытные пробы также наблюдается уменьшение дезаминирования бензиламина, и процент ингибирования с дозой 1,3 1 О И находится в пределах55,5 - 76,37,78125 6 но в концентрации 1,3 1 О-фМ препараты 1 и 111 не эффективны как ингибиторы деэаминирования бенэиламина, и.процент ингибирования - от .0 до б,бЕ. Тогда как препарат 11 - структурный изомер (1) - и в меньшей концентрации активно тормозит деза- минирование бензиламина: на 58,4 Х. П р и м е р 5. Исследование влияния диализа на торможение дезаминирования серотонина в гомогенатах печени быка в присутствии ингибиторов(1), (11) и (111),Берут гомогенат, приготовленный,как описано в примере 4, серия 1,наливают 1 мп его в пеницилиновуюсклянку, куда также добавляют поО, мл ингибитора (концентрация 1,3 х х 10 ). Отверстие в склянке завязывают целлофаном. Склянку укреппяютвверх дном в сосуде, заполненном0,2 М раствором фосфатного буфера, ипомещают этот сосуд в холодипьник,Буферный раствор в склянке время от времени меняют свежими порциями охлажденного фосфатного буфера. Через 2 сут вынимают склянки и их содержимое центрифугируют на холоду (не выше 4 С). К осадку гомогената добаволяют 1 мл фосфатного буфера, субстрат серотонин и пробы инкубируют как описано в примере 4, серия 1. В аналогичных условиях 2 сут в процессе диапиза находится гомогенат, который затем идет на холостые и контрольные опыты. В итоге сравнивают, сколько аммиака выделяется в диализируемых пробах с ингибиторами и без ингибиторов и пересчитывают на 100 мг веса. Найдено: в контроле 4,7+0,1 мкмольаммиака на 100 мг веса ткани, в опыте с ингибиторами; (1) - 0,2+(111) - 1,60,2 на 100 мг веса сухой ткани гомогената. Процент ингибирования после диализа составляет.соответственно 47,3; 46,8; 66,0 Е(табл.2). Следовательно, икгибирование дезаминирования серотонина в гомогенатах печени быка сохраняется ипосле диализа, так как восстановление активности дезаминирующего фермента не происходит (табл.2).П р и м е р 6. Исследование влияния препаратов (1), (11), (111) и ниаламида на окислительное дезаминирование серотонина и бензиламина в гомогенатах печени глухаря,В аналогичных условиях, которыеописаны в примере 4, исследовано дезаминирование бензиламина (табл.3)и серотонина (табл.4) в гомогенатахпечени глухаря в присутствии препаратов (1), (11), (111) и ниаламида.Последний взят для сравнения как известный ингибитор моноаминооксидазы,дезаминирующей серотонин и бензиламин. Опыты проведены .и уго также,как с гомогенатами печени быка (приер 4). Ниаламид вносится в пробыедующим образом: 3,9 мг растворяЦт в 1 мп фосфатного бУФера или в10 мп в зависимости от применяемойконцентрации и помещают в склянкийо 0,1 мл,Результаты приведены в табл. 3 и4Все три препарата (1), (11), (111) 20каждой из исследованных концентраций угнетают дезаминирование серотонина и бензиламина. ЗЖФект ингибирования не является зависимым пропорционально концентрации препаратов, 25Йаиболее активно соединение (111),которое угнетает дезаминирование серототина на 65 %, а бензиламина -на 85 %. Практически такими же поЭФфективности являются соединения 30Ви Б. Они угнетают цезаминироВание бензиламина на 64 - 83%. Всетри препарата (1), (11) и (111)Проявляют большой ингибирующий эект в отношении дезаминирования бензиламина в печени птиц по сравнениюс серотонином, Особенно это характерно для препарата (111), который вобеих иаследованных концентрациях тормозит дезаминирование сер отонина на83 - 85%.П р и м е р 7. Исследование влияния препарата и-нитробензилиденамино -этанола (Б) на дезамивирование серотонина в гомогенатах печени и мозга мышей.Серия 1. Препарат п-нитробензилиденаминоэтанол (11) вводится в дозе200 мг/кг, составляющей 7,8 от суточной ЛД п дл Я Него И)ппи В 3 я ТЫ Ма сс ой 50тела 19 - 23 г. Поэтому, например,мьппи с массой тела 19 г получали3,8 мг, а с массой тела 23 г - 4,6 мгпр епар ата в нутрибрюшинно, р ас творенного в 1 мп дистиллированной воде.Контрольным машам одновременно вводят дистиллированную воду также вколичестве 1 мл. Через 18 ч послевведения препаратов и воды мьппей забивают декапитированием. Немедленнона холоду извлекают мозг и печень.Затем из тканей этих органов получают гомогенаты, которые проводят через все процедуры, предусмотренныеметодикой и описанные в примере 4.Результаты приведены в табл,5.В пробах с гомогенатами печениопытных мышей выделяется аммиака0,34 мкмоль, а в контрольных "5,5 мкмоль аммиака на 100 мг весасухой ткани гомогената. В пробах сгомогенатами мозга с препаратом Б найдено 1,7 мкмапь, а в контрольных -16,2 мкмопь, что составляет 907,торможения дезаминирования серототина.Серия 2. Исследование влияния препарата Бна 5-окситриптоановый(5-ОТФ ) гиперкинезе. Берут контрольных и опытных мышей массой тела 6 -25 г и всем вводят 5-ОТФ 50 мг/кгвнутрибрюшинно, Опытные отличаютсяот контрольных тем, что за 2 ч до5-ОТФ получали препарат Бв дозе200 мг/кг массы тела, Через 15 мнпосле введения 5-ОТФ подсчитываютколичество в стряхивающих движенийголовой у мышей в опыте и контроле.Количество в стряхивающих движенийголовой у мышей в контроле в среднем на 1 мышь (из 50) составляет0,6, т.е. не все мьппи в ответ на введение 5-ОТФ производят движение головой,У опытных мышей эйФект 5-ОТФ значительно потенциирует и составляетв среднем 11,6 движений на 1 мьппьиз трех, Следовательно, препаратБпредотвращает разрушение серотонина в мозге, который образуется от5-ОТФ п чло.П р и м е р 8. Определение токсичности препарата на примере препарата (1). Препарат суспензируют в крахмальном клейстере и вводят мьппамрег оз шприцем с инъекционной иглойс булавовидным утолщением на конце,Варьируют дозы 1000 - 2500 мг/кгв сериях из 8 мьппей.Результат: ЛД у препар ата ( 1 ) сос тавляет 1563 мг/кг, т. е. препарат является нетоксичным.Формула изобр етенияПрименение замещенных бензилиденаминоэтанолов общей Формулы1578125 10в качестве ингибиторов Фермента моноаминооксидазы.л Та блиц а 1 Влияние препарата на окислительноедезаминирование серотонина и бензиламинав гомогенатах печени крупного рогатогоскота Х ннгибирования Х ингиби- Субстрат бенрования зиламин,мкмапь аммиака Субстрат серотонин,мкмопьаммиака Пр епа- Концентрацияр ат пр.епар ата,М 3 05.2 .вем 2. в е 69,4 9,8 +0,30 5 50 19т 43,99,8+ 0,30 2 85+1 42.: 2, 58,4 6,85 +0,8 1,3 х 102 60 + 1 05х = ь 62,0 6,85 + 0,8 111 1 3 х 1007103Ф92 99,8+ 0,3У 1,3 х 1 О 8 50+1 80,0 6,85 ф 0,8 14+00 85,5 9,8 ф 0,3 П р и м е ч а н и е. Концентрация субстратов - 4опыты с ингибитором, а под (без ингибитора). Приведены и = 3 - 5 опытов п = 2,х 10- М. Над чертой -чертой - контрользначения Мщ Т аблиц а 2Влияние диализа на окислительное дезаминированиесеротонина гомогенатами печени быка в присутствииингибиторов ИнгибиДезаминирование серотина,мкмоль 7 торы1,3 х 10- М с препаратами контроль П р и м е ч а н и е, Приведены средние величиныМ+ш; количество опытов равно 3. 111111 4,7+ 0,14,7+ 0,014,7+0,12,0 Й 0)032,5 1 0,21,6 + 0,02 7 ингибирования последиапиза 47,5 468 66,012 15 78125 Таблица 3 Влияние препаратов на разрушение бензиламинагомогенатами печени глухаря (Тетгао цгода 11 цв) Концентрация,М Угнетение активности моноаминокси- дазы Пр епарат1 кмоль 72+ 0 О 0,3 х 10 85,10 е 0,51 6,71+ 0,04 е. Приведены с щие степень П едние тормож а н ни ем сравне ). Кол блица Влияние препаратов на разрушение серотонинагомогенатами печени глухаря (Тетгао цгода 11 ц епет ентрация, Угнетение активности моноаминооксидазы М 1 мк моль 7 43+ 0 03 1,3 х 1 О 1,82 0,64,0 +0,0 1 4 ФО 0 4 0 44,78+ 0,64 46,06+ 0,42 64,98+0,9864,24+ 0,41 начения Мш, выражаю ния разрушения субс препарата (наднию с контролем чество опытов 3,45,46 + 0,9 60,00+ 0,73 14 1578125 Продолжение табл.4 Пр епарат Конц ен тр ация,М37,50+ 0,50 Таблица 5 Влияние препарата (П) на дезаминирование серотонина в гомогенатах печени и мозга мышей в опытах Ы чиччо через18 ч поспе введения в дозе 200 мг/кг внутрибрюшинно Разрушение серотонина,мкмоль на 100 мг сухого гомогената, и его угнетение,. Х: М+ш в мозгеОпыт онтроль 7. угнетения Опыт Контроль Е угнетения11,6 + 0,7п = 3 0,6+ 0,06и 50 Корректор Т, Малец Редактор Т. Лазоренко Ы Заказ 1888 Тираж 336 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5ЪУгнетение активности моноамннооксидазы Таблиц а 6 Влияние препарата (11) на 5-окситриптврановый гиперкинез Количество встряхиваюших движений головой у мышей после введения 5-окситриптофана (50 мг/кг) и совместно с препаратам (200 мг/кг) внутрибрюшинно (М+ш) 3 фСоставитель А.СеменовТехред Л.Сердюкова