Способ получения биомассы

1 и 42 И 99 ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социвлистических Республик(61) Зависимый от патентаГасударственный комитет Соввта Министров СССР ао делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретени Иностранцы ласс, Джон Дж. Иандоло и Д(США) Иностранная фирма Институт оф Газ Текнолоджи(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ икробиологичесред ции. Изобретение относится к мской промышленности.Известны способы получения биомассы, используемой в кормовых и пищевых целях, заключающиеся во внесении посевного материала - микроорганизмов, выбираемых из родовРзецйо 1 попаз, Вас 111 пз и Мейапотпаз, в водную питательную среду, культивировании посевного материала и отделении биомассы откультуральной среды. 1 ОПри этом культивирование посевного материала осуществляется на питательной среде,содержащей источники углерода, азота и необходимые для роста микроогранизмов минеральные соли, Однако такие способы не обеспечивают получение биомассы, богатой аминокислотами, протеинами и витаминами такэффективно, как предлагаемый способ.Цель изобретения - обогащение биомассыперечисленными веществами и более полное 20использование питательной среды.Это достигается тем, что источник углеродавносят в питательную среду непрерывно,после достижения оптимальной фазы развитиямикроорганизмов, а в качестве источника углерода используют смесь метана с кислородом,При этом отделение биомассы от культуральной среды осуществляют одновременно свнесением источника углерода в питательную ЗО часть среды подвергают рециркуляВ рециркулируемую культуральпую среду вводят растворы минеральных солей в концентрациях, меньших первоначально добавляемых. При этом источник азота вводят в виде газообразного аммиака, гилрата окиси аммония или солей аммиака.Получение биомассы по предложенному способу осуществляют следующим образом. В водную питательную среду при рН от 6 до,5 вносят посевной материал.Питательная среда содержит по меньшей мере 0,005 г/л иона магния, 0,0025 г/л иона кальция, 0,001 г/л иона железа, а также источник азота в лиде вышеперечисленных добавок.Засеянную питательную среду выдерживают при температуре 20 - 40 С,После достижения оптимальнои фазы развития микроорганизмов в выдержанную питательную среду при ее перемешивании непрерывно вводят газообразную смесь из метана и кислорода.Эта смесь может содержать 3 - 97 об. % кислорода и 1 - 97 об. % метана.При этом одновременно с непрерывной подачей газообразной смеси производят непрерывный отвод из ферментатора жидкой сре(ИН,)504Мф 04 7 Н,ОСаСРе 504 7 Н,ОМп 504 Н,ОМ 00311114 03ИН 40 Н (аммиачная вода)РеС 1,РеС 1,0,00011,000,005 0,002 ды, отделение биомассы от культуральной среды и рециркуляцию ее части в фермеытаторе.В состав рециркулируемой среды перед,подачей ее в ферментатор вводят растворимые соли магния и аммония. При этом растворимые соли аммония добавляют в количестве, обеспечивающем суммарную концентрацию иона аммония, образуемого за счет подачи газообразного аммиака и упомянутых растворимых солей аммония, составляющую 0,1 - 5 г/л.Для отделения биомассы от культуральной среды отводимую из ферментатора жидкую среду с кислотным продуктом фильтруют с последующей его промывкой жидкостью из воды и растворов солей.Промытую таким образом биомассу высушивают на воздухе при комнатной температуре или путем ее нагревания до температуры, не превышающей 105 Г при атмосферном или пониженном давлении.Посевным материалом могут служить микроорганизмы, например, из АТСС 21310 рода Среды А - Г пригодны для проведения культивирования по периодическому методу, а среды Д - Ж для непрерывных процессов.Контроль за величиной рН при непрерывном процессе осуществляют путем раздельного добавления кислоты или,щелочи. П р и м е р 1. Для определения влияния различных концентраций иона аммония на концентрацию продукта микроорганизма АТСС 21310 культивируют на среде А с различными концентрациями сульфата аммония.Концентрацию, продукта определяют через 166 час при 420 ммк при периодической подаче питающей смеси газа из 56% метана и 44%кислорода.При непрерывной, подаче газовая смесь состоит из 50% метана и 50% кислорода.При проведении 15 опытов (7 - при непрерывной подаче газа и 8 - при периодической подаче газа) в каждом отдельном случае применяют различную концентрацию сульфата аммония в,пределах от 0 до 10 г/л. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 4Рзецдогпопаз, который способен окислять метан и природный нефтяной газ в составе питательной среды, содержащей только одни минеральные соли, для получения биомассы с высоким содержанием аминокислот, протеинов и витаминов.Данную культуру можно выделить в чистом виде с использованием среды, содержащей названные минеральные соли, из смешанной. культуры АТСС 19385.Микроорганизмы АТСС 21310 культивируют на различных средах, содержащих минеральные соли, источники азота и углерода.В качестве последнего может быть метан или природный нефтяной газ в смеси с кислородом или воздухом с добавлением углекиского газа или без него.Скорость роста АТСС 21310 равна нулю при 20 и 40 С, умеренная,при 25 С и имеет оптимальное значение при температурах 30 - 38 С.Предпочтительные составы питательных сред для АТСС 21310 приведены в табл. 1.Таблица 1 Максимальный выход АТСС 21310, а также максимальное содержание протеина в продукте установлено на средах с концентрацией сульфата аммония в пределах 0,5 - 3,5 г/л.П р и м е р 2. Культуру микроорганизма АТСС 21310 выращивают на среде А при непрерывном перемешивании и возрастающем добавлении ИаОН или (ХН 2) 804 для поддержания рН среды в пределах 6,0 - 7,5, являющейся оптимальной для роста данного микроорганизма. 1 г КаОН и 1 г МН 4804 добавляют в 50 мл среды на 140 час 0,75 г КаОН и 1 г КН 4804 в 10 мл среды - на 168 и 185 час.Состав питающего газа: 49% метана и 52% жислорода при его,подаче 87 мл/мин через барботер.При указанных условиях, близких к непрерывной ферментации, выход клеточного материала, превышает 5 т/л,П р и м е р 3. Серию культур выращивают при перемешивании и комнатной температуре на среде А с различными источниками азота.421199 б Культуру микроогранизма выделяют через 640 час культивирования.В качестве источников азота используют азотнокислый натрий, азотнокислый аммоний, гидрат окиси аммония, азот и сернокислый аммоний.В качестве источника углерода используют газовую смесь из 40% метана, 40% кислорода и 20% азота под давлением 0,141 кг/см. Результаты исследования клеток и сравни.5 тельные данные, получаемые во время. форментации на среде с различными источникамиазота, приведены в табл. 2,Таблица 2 Источник азота В составе газовой смеси(ИН ), БО ИН,ОН ИН 4 ЫОЗ 1 ча 1 ч 0 ,18 1,0011,4 0,11 19 1,10 9,5 0,10 22 0,5510,4 0,06 32 0,5010,0 0,05 0,11 55 50 30 25 59 63 П р и и е р 4. Исследуют влияние сниженияконцентраций иона магния в среде А. Результаты этих опытов приведены в20 табл. 3 и 4. Культуру АТСС 21310 получают в колбах в среде А, в которой концентрации ионов магния были понижены до 20, 40 и 60% от суммарного содержания редкоземельных элементов в обычной среде А. Таблица 3 Концентрация, г/л Составные части Среда среды И В соответствии,с лолученными данными выход АТСС 21310 снижается при уменьшении концентрации ионов магния более, чем на 50% против обычно содержащихся в среде А. 4,021,361,000,200,000750,00050,000190,00015 Иа,НРО, 7 НОКН,РО(ИН 4)804МАЗО,.Н,ОСаС 1,ге 804 7 Н,ОМпЮ, НОМоОз 4,02 1,36 1,00 0,20 0,0075 0,005 0,0019 0,0015 4,02 1,36 1,00 0,20 4,02 1,36 1,00 Время удвоения АТСС 21310 Сухой вес АТСС 21310, мг/мл среды Содержание азота АТСС 21320, вес, о Клеточный азот, мг/мл среды Наличный неорганический азот, утилизованный клетками, вес. Ц Содержание протеина АТСС 21310,вес, ,Г Полученные результаты показывают, что содержание протеина у клеток примерно одинаково и независимо от выбранного источника азота. Ион аммония обеспечивает более короткие промежутки времени удвоения, более высокие плотности клеточного материала и более высокую степень утилизации азота по сравнению ,с одним нитрат в ионом или нитрат в ионом совместно с ионом аммония. П р и и е р 5. Среду, не содержащую клеток, извлекают после каждого из одинаковых опытов по ферментации. В каждом случае анализируют на содержание элементов металлов путем атомной абсорбционной спектрометрии. Полученные данные сравнивают,с соответствующими данными анализа для свежей среды А.Сравнение показывает, что ион магния постепенно поглощается клетками.по мере лрохождения процесса ферментации. Следовательно, рециркулируемую среду необходимо пополнять ионом магния до подачи в ферментатор при работе по непрерывнаму методу. Другие ионы металлов не потребляются клетками в значительной степени и добавления этих ионов 10 не требуется. При последующих опытах удаление микроэлементов, иных чем магний, вызывает дополнительное понижение роста и выхода АТСС 15 21310. Удаление иона магния приводит, в основном, к прекращению роста, что свидетельствует с важности иона магния. П р и м е ч а н и е. Среда 3 представляет собой среду А, содержащую 10 о, компонентов в виде микроэлементов (СаС 1 РеБО 7 Н,О, Ма 304 НО,40 МоОЗ); среда И не содержит микроэлементов; среда К не содержит микроэлементов, а также Мф 04 7 Н,О. Все среды готовят на дистиллйрованной воде, В табл. 4 дана оценка модификаций сре 45 ды А.421199 Таблица 4 Оптическая плотность при 420 ммкВремя выращивания культуры, час Среда 119 142 239 70 0,02 3,60 2,40 1,45 0,13 0,02 1,12 0,44 0,40 0,13 0,02 0,49 0,26 0,35 0,11 0,02 2,65 1,65 0,95 0,16 0,02 0,11 0,09 0,13 0,07 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 Дистиллированная водаА 3 И К П р и м е ч а н и е. Оптическая плотность определяется для каждой переменной величины и является среднейдля двух культур. Ферментацию проводят в колбах по 1000 мл при комнатной температуре в 500 мл среды А. Исходный газ подают под давлением 0,281 кг/см.Повторное заполнение колб газом проводят ежедневно. Условия ферментации: ферментацию проводят при комнатной температуре в 200 мл среды, состав которой приведен в табл. 3, Исходная газовая смесь содержит, об. %: метан 40, кислород 40, азот 20. Давление поддерживают на уровне 0,281 кг/см колбы.П р и м е р 6. Исследуют влияние концентрации иона магния на рост микроорганизма. Проводят серию опытов, при которых АТСС 21310 культивируют в модифицированной среде А, которая содержит Мд 504 7 Н,О в количествах от 0,0 до 2,0 г/л среды, Условия ферментации: комнатная температура, 100 мл среды А с заданными концентрациями Мд 804 7 Н 20; исходная газовая смесь, содержащая, %: метан 40, кислород 40, азот 20,Давление поддерживают на уровне 0,28 кг/см.Результатыполученные при,проведении серии опытов, доказывают, что чем выше концентрация Мд 504 7 НО, тем интенсивнее происходит рост микроорганизмов.При этом было установлено, что входящие в состав среды ионы кальция или железа, используемые в виде растворимых солей, существенно снижают скорость роста и выход биомассы,Ионы молибдена и марганца могут быть удалены без торможения роста.П р и м е р 7. Исследуют влияние состава исходного питающего газа па скорость роста микроорганизма.Опыты проводят:по выращиванию АТСС 21310 с использованием исходной газовой смеси следующего состава, %:Опыт 1 метан 3, кислород 97.Опыт 2 метан 40, кислород 40.Опыт 3 метан 97, азот 20, кислород 40,При приведенных выше периодических условиях проведения опытов установлено, чтопри подаче газовой смеси, содержащей97 об. % кислорода, роста по существу не5 наблюдается, При исходной газовой смеси, содержащей 97 об. % метана отмечается лишьумеренный рост.Исходная смесь, содержащая равные объемы метана и кислорода явственно способст 10 вует повышенным скоростям роста, При этомустановлено, что предпочтительные составыгазовой смеси, способствующие более высоким скоростям роста, соответствуют примерностехиометрическим количествам растворенных15 в жидкой среде метана и кислорода. Могутприменяться смеси, содержащие не менее3 об. % кислорода и не более 97 об. % кислорода,П р и и е р 8. Этот пример иллюстрирует20 случай рециркуляций культуральной среды,извлекаемой из ферментатора. Перемешиваемую культуру Мейопогпопаз гпейап 1 са, выращенную в среде В, выдерживают при 25 Си непрерывной подаче газовой смеси, состоя 25 щей из природного нефтяного газа и воздухав соотношении 20: 80, В логарифмической фазе выращивания культуру выдерживают дотех пор, пока плотность клеточного материалане достигает 1,0 г/л. После этого среду извле 30 кают и биомассу отделяют фильтрованием ицептрифугированием. Затем регенерированную среду возвращают в ферментатор, где ееповтооно засевают дозой отделенного клеточного материала. Концентрация Мд 504 7 НО,35 (ИН 4)2504 в регенерированной среде, направленной в ферментатор, поддерживают на уровне 1,00 и 1,50 г/л,путем периодического внесения в нее соответствующих добавок.Биомасса микроорганизма АТСС 21310 по40 ее питательной ценности приближается к соевой рыбной муке. Сравнительный аминокислотный состав протеина, полученного из метана, а также из сое вой и рыбной муки приведен в табл. 5.Основные аминокислоты ЛейцинВалинЛизинфенилаланинГреонинИзолейцинТирозинМетионинЦистинТриптофанНесущественные аминокислотыГлютаминовая кислота Аспарагиновая кислота АланииСерииГлицинАргининПролинГистидин 8,19 6,64 5,87 4,81 4,64 4,57 3,86 1,48 0,26 (3,81) ф 6,4 4,5 6,7 3,4 3,8 3,8 2,8 2,4 (0,9)фф (0,9)фф 7,6 5,2 6,6 4,8 3,9 5,8 3,2 1,1 1,2 1,2 11,15 9,57 9,18 7,61 6,05 5,70 4,14 2,38 13,4 8,6 6,3 4,1 9,3 6,1 5,5 2,0 18,5 3,8 5,6 8,3 7,0 5,4 2,5 ф По разности;фф Отдельные определения. Предмет изобретения Составитель А, БражниковаТехред А. Камышникова Корректор М. Лейзерман Редактор А. Бер Заказ 1813/12 Изд.664 Тираж 456 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д 4/5Типография, пр Сапунова, 2 1, Способ получения биомассы, используемой в кормовых и пищевых целях, путем внесения посевного материала из родов Ряецйотопая Вас 111 ця, Мейапотая в водную питательную среду, содержащую источники углерода, азота и необходимые для роста микроорганизмов минеральные соли, культивирования посевного материала и отделения биомассы от культуральной среды, о т л,и ч а ю щ и йся тем, что, с целью обогащения биомассы аминокислотами, протеинами и витаминами и 10 более полного использования среды, внесениеисточника углерода осуществляют непрерывно с наступлением оптимальной фазы развития микроорганизмов, используя в качестве источника углерода смесь метана с кислоро дом, при этом одновременно с внесением его впитательную среду осуществляют отделение биомассы от культуральной среды, отвод последней и рециркуляцию ее части в процессе выращивания.20 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что питательную среду перед введением в нее источника углерода выдерживают при 20 - 40 С и рН 6,0 - 7,5.3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся 25 тем, что источник азота вводят в виде газообразного аммиака, гидрата окиси аммония или солей аммония.4. Способ по пп. 1 - 3, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что в рециркулируемую среду вводят не обходимые минеральные соли в концентрациях, меньших первоначально добавляемых солей, вводя необходимые их растворы,