Способ приготовления иммунофлюоресцентных

О П И С А Н И Е ЗУО 497ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социзлистическил РеспубликЗависимое от авт. свидетельства1652769/31-16 Заявлено 20,17.1971 с присоединением з 6 01 п 1/30 киКомитет по аслам изобретений и открыти при Совете Министров СССР(088.8) та опубликования описания 23.1 У.197 у, Кармышева, Л. М. Фарутина и титут полиомиелита и вирусныхАкадемии медицинских наук энцефалитоСССР ФЛЮОРЕСЦЕ ПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИММ ПРЕПАРАТИзобретение относится к области медицины.Известен способ приготовления иммунофлюоресцентных препаратов, заключающийся в том, что в исследуемые объекты вводят радиоактивную метку с последующей фиксацией в ацетоне, промывкой, очисткой от радиоактивных примесей, сушкой, нанесением на препарат иммунной сыворотки, исследованием препарата в люминесцентном микроскопе, определением локализации и количества антигенов с последующим покрытием препарата светочувствительной фотопленкой и выявлением химических компонентов, известными и применяемыми при радиоавтографических методах исследования.Однако этот способ не позволяет одновременно исследовать локализацию и количество антигенов и химических компонентов в одной и той же структуре.В предлагаемом способе в отличие от известных фиксацию объекта проводят в спирт- уксусной кислоте с последующим нанесением светочувствительной эмульсии в концентрации 1: 2, выдерживании с ней препарата и нанесением иммунной сыворотки после проявления и обработки на 60 мин при 37 С,П р и м е р, В качестве модели используютперевиваемые культуры клеток почек сирийского хомяка, выращенные на покровных стеклах и зараженные вирусами Астра и Ибадан. Через трое суток после заражения в культуральную жидкость добавляют предшественник РНК уридин И в дозе 5 рС на 1 мл на 24 час.Через 24 час культуры отмывают от среды 5 физиологическим раствором и фиксируютсмесью спирт-уксусной кислоты (3: 1) в течение 15 - 20 мин, затем промывают вО-градусном спирте 5 лтин и помещают в 37 ю-ну 1 о хлорную кислоту на 20 лтин при 4"С. 11 осле 0 этого препараты отмывают в проточной водеи нескольких порциях дистиллированной воды 40 мин и сушат.Покровные стекла наклеивают канадскимбальзамом на предметные стекла культурой 5 вверх. Необходимость в этом отпадает при выращивании культуры на предметных стекла.;.Препараты покрывают тонким слоем разведенной 1: 2 светочувствительной эмульсией типа М при 42 С (светофильтр желто-зеленый 20 117 или 118) и помещают в герметпзпровапные лейкопластырем светонепроницаемые ящики в холодильник при 4 С на 5 суток до появления нужного количества зерен серебра.Затем препараты проявляют в ампдоловом 25 проявителе для авторадиографип 2,5 псин прп18 С, промывают 1 мин дистиллированной водой, фиксируют 30%-ным раствором гппосульфита 10 лтин, промывают в проточной воде 60 мин и споласкивают в дистиллированной 30 воде. На препараты, помещенные в влажные370497 Предмет изобретения Составитель С. ЩеневаТехред 3, Тараненко Корректор А Степанова Редактор Т. Шагаева Заказ 1087/1 Изд. Мо 364 Тираж 755 Подписное ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий прн Совете Министров СССР Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 камеры, наносят меченую изотиоцианатом флюоресцеина иммунную сыворотку па 40 - бО иин прп 37 С, после чего препараты промывают в нескольких порциях забуференного физиологического раствора (рН 7,2 - 7,4) в течение 15 - 20 иин, споласкивают дистиллированной водой и подсушивают,Лезвием бритвы осторожно отделяют препарат - покровное стекло, протирают нижнюю часть ксилолом или бензолом для удаления бальзама и осторожно небольшой каплей бальзама (или подходящего клея) подклеивают с одного края препарат на чистое предметное стекло, чтобы бальзам не растекся, так как он сильно флюоресцирует. Необходимость в этом отпадает при выращивании культур на предметных стеклах.Препараты просматривают в люминесцентном микроскопе без покровных стекол, не заключая в забуференный глицерин. Места синтеза РНК учитывают по черным зернам серебра, которые можно подсчитать, меняя глубину фокуса микровинтом.Места локализации антигена в ядрах и цитоплазме клеток на том же препарате учитывают по яркой зеленой флюоресценции. Прпредлагаемом способе иммунофлюоресценцпя не нарушается ни слоем фотоэмульсии, ни скоплениями зерен серебра.5 Способ приготовления иммунофлюорес 11 ентных препаратов путем введения в исследуемые 10 объекты радиоактивной метки с последующейфиксацией, промывкой, покрытием светочувствительным материалом, очисткой от радиоактивных примесей, проявлением сушкой с последующим нанесением сыворотки для иссле дования в люминесцентном микроскопе, отличающийся тем, что, с целью одновременного исследования локализации и количества в одной и той же структуре антигенов и химических компонентов, фиксацию объекта прово дят в спирт-уксусной кислоте с последующим нанесением светочувствительной эмульсии в концентрации 1:2, выдерживании с ней препарата и нанесейием иммунной сыворотки после проявления и обраоотки на 60 мин при 25 37 С.