Способ получения целлюлазы

О П И С А Н И Е 368303ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советсних Социалистичесних РеспублинЗависимое от авт. сви ельства 11.1970 ( 1494263/28-13 л, С 120 13/1 Заявле присоединением ваяв Приорите Номитет по делам изобретений и отнрытийоллетень9 К 577.15.07(0 бликовано 26.1.1973 при Совете Министре СССРДата опубликования описания 9,1 Ч.19 Авторыизобретения Р. В. Фениксова,И, А, Тиунова, Н, А, Родион И, Сидорова и Л. И, Марти Ленина институт биохимии и а, 1 ович Вс:.,р(.) 1 С 31-1, 1.1Н Баха :п;тгт"гйъ Ордена В. И е Б ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗЬ ста можно исиз пшеничных семян в ко;шИзобретение относится к производству ферментных препаратов, а именно к способу получения целлюлазы.Известен способ получения целлюлазы путем выращивания ее продуцентов на пита тельной среде, содержащей, источник углерода, азота в присутствии минеральных солей и стимуляторов роста.Предлагаемый способ позволяет повысить выход и стабильность фермента. 10Для этого в качестве продуцента целлюлозы используют грибы вида Стео 1 г 1 с 1 тцпт сайг 1 цгп. Можно использовать штамм бео 1 г 1 с 1 тцгп сапйдцгпЗс.В качестве источника углерода целесообраз но использовать свекловичный жом или фильтровальную бумагу в количестве 2%.В качестве минеральных солей можно использовать КНзРО 4, Мд 504 7 НзО в количестве, преимущественно равном 0,1 и 0,005%. 20В качестве источника азота можно использовать неорганические соли, такие, как (ХН 4)е 504 и 1 Х 1 а 1 Х 10 з в количестве соответственно, равном по 0,15%.В качестве стимуляторов ро 5 пользовать 10%-ный экстрактотрубей или муку из хлопковыхчестве 1 % .Гриб бео 1 г 1 с)тцгп сапг 1 Ыцгп выделен из гниющей древесины. 30Гриб синтезирует и выделяет в среду высокоактивную систему ферментов, состоящую из СС, ферментов и целлобиазы, способных расщеплять нативную, высокоупорядоченную форму целлюлозы до растворимых сахаров с преобладанием глюкозы (70% от количества всех образуемых восстанавливающих сахаров).Токсическими свойствами гриб бео 1 г 1 сйцгпе сапйЫцгп не обладает.Культурально-морфологическая характеристика штамма бео 1 пс 1 тцгп сапс 1 ЫцтпЗс на 10 сутки роста.На синтетической среде Чапека с сахарозой и ХаХОз колонии диаметром 25 - 30 лглт с ровным краем, радиально складчатые. Воздушный мицелий порошистый, скудный, прижатый, белый. Обратная сторона колонии желтоватая, пигмента нет,На сусло агаре (сусло 5 по Баллингу) колонии диаметром 35 лглт с глубокими радиальными складками, с ровным краем слегка вдавленным в агар, слабо зональные.Воздушный мицелий белый, тяжистый, шерстистый. Обратная сторона колонии желтовато-бурая, пигмента нет. В центре колонии крупные капли желтовато-коричневого эксудата.10%-ный экстракт из отрубей получают следующим образом. 100 г пшеничных отрубей в 1 .г воды автоклавируют (1 атлг, 30 лтин), отжимают через капрон и полученный экстракт используют для приготовления среды. Экстракт из отрубей можно заменить добавлением 1% муки из хлопковых семян.Температура выращивания 28, аэрация 1 - 2 объема воздуха на 1 объем среды в 1,чин, скорость вращения мешалки 200 - 400 об/,иин, длительность культивирования 3 - 4 суток,368303 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Заказ 669/9 Изд. Мф 210 Тираж 467 Подписное ЦНИИПИ Сапунова, 2 Типография, пр,Лктивность полученного фермента. 1 мл культуральной жидкости этого гриба расщепляют с образованием восстанавливающих сахаров хроматографическую бумагу Ватман Мз 1, взятую в количестве 20 мг на 5 мл реакционной смеси при 40 С за 1 час на 6,0/, и за 24 час на 70 %Сульфитная беленая еловая целлюлоза осахаривается неразведенной культуральной жидкостью при 40 и концентрации субстрата в 5 о/о з а 6 суток на 60 о/о и за 12 суток на 75,2 о/о, накапливая до 3,5% сахаров в инкубационной смеси.Культуральная жидкость этого гриба способна расщеплять до сахаров нативную высокоупорядоченнуо целлюлозу, такую, как хлопковое волокно, при концентрации субстрата 0,07% и 40 С, рН 4,7 за 7 и 20 дней на 53 и 90 о/о соответственно.Линт при концентрации в 5%, рН 4,7,40 С расщеплялся неразбавленной культуральной жддкостью за 8 дней на 39 и за 14 дней на 57 о/о, давая 1,9 и 2,8/о восстанавливающих сахаров в реакционной смеси соответственно.При действии на карбоксиметилцеллюлозу 1 мл культуральной жидкости дает 4 условные единицы активности по методу Витакера при 40 С и 15 мг восстанавливающих сахаров за 1 час при 40 С, рН 5,6 и 1/о концентрации су 6 стр ата.На среде состава (в /о):Фильтровальная бумага(МН 4) г 504 1,5 КН 2 Р 04 0,1Мд 504 7 НгО 0,05 500 мл 10/о-ного экстракта из пшеничных отрубей на 1 л средыВода водопроводная До 1 л Колонии диаметром 25 - 30 мм с ровным краем, не складчатые, слегка зональные, белые, с порошистой массой артроспор.Воздушный мицелий белый, шерстистый, слегка прижатый. Обратная сторона колонии желтоватая. Пигмента нет.Морфологическая характеристика бео 1 г 1 сйцш сапЙЫцгп на всех указанных средах сходна. Гифы стелющиеся, слабо септированные. Мицелий слаборазвитый. Спороносные гифы короткие прямостоящие или приподнимающиеся, септированные. Конидии, образующиеся по типу артроспор, короткоцилиндрические с усеченными (обрубленными) концами 5 - 10 К 4 мк, бесцветные в цепочках.Пример культивирования гриба и получения ферм ентного п реп ар ата.Посевным материалом может служить водная суспензия конидий (10 о конидий в 1 мл) или мицелиальная культура двухсуточного возраста. Выращивание гриба проводят на среде следующего состава (в о ):Фильтровальная бумага(1 Н,) гО, 0,15КН 2 Р 04 0,1Мд 504 7 НгО 0,05.Среду готовят на водопроводной воде с добавлением 300 мл 10 о/о;ного экстракта из пшеничных отрубей на 1 л среды.Жом отмывают от пектиновых веществ следующим способом.100 г жома в 1 л воды автоклавируют(1 атм, 0,5 час), затем промывают горячей водой и сушат на воздухе,Выход фермента из культуральной жидкости при осаждении 4 объемами этиловогоспирта составляет 7 г из 1 л; осаждение фермента при 80 о/о-ном насыщении сернокислымаммонием дает 3,5 г препарата из 1 л культуральной жидкости гриба с активностью, в2 раза превышающей активность препарата,осажденного спиртом.В процессе получения сухого препарата вобоих случаях активность целлюлолитических ферментов снижается примерно на ЗОо/о. Предмет изобретения 1. Способ получения целлюлазы путем выращивания ее продуцентов на питательной среде, содержащей источник углерода, азота в присутствии минеральных солей и стимуля. торов роста, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и стабильности фермента, в качестве продуцента целлюлазы используют гриб вида бео 1 г 1 сйшп сапс 1 Ыцт.2. Способ по п, 1, отличающийся тем, ччо используют штамм бео 1 г 1 сЬцт сапййцт Ха Зс.3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве источника углерода,используют свекловичный жом в количестве 2 о/о4. Способ по пп. 1,и 2, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют фильтровальную бумагу в количестве 2%.5, Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве минеральных солей используют КНгР 04, МдЯ 04 7 НгО в количестве, преимущественно равном 0,1 и 0,05 о/о6. Способ по пп, 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве источника азота используют неорганические соли, такие, как (ИН 4)г 504 и МаИОз в количестве, соответственно равном по 0,15%7. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве стимуляторов роста используют 10%-ный экстракт из пшеничных отрубей.8. Способ по пп. 1,и 2, отличающийся тем, что в качестве стимулятора роста используют муку из хлопковых семян в количестве 1%,