Способ получения лектина

(5)5 А 61 К 35/78 сиоеврЩЩна- тихнцц ЙИБ/.,; -,. Е О К АВТО и ии и з ко- изо- пени экст- жноГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) АНИЕ ИЗОБ МУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Львовский государственный медиский институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКТИНА(57) Изобретение относится к биохимкасается способа получения лектина иры робинии ложноакациевой. Цельюбретения является повышение стечистоты. Способ осуществляют путемракции измельченной коры робинии ло чИзобретение относится к получению биологически активных веществ, в частности, к способам получения лектина из коры йоЬп)а рзеобоасаса , Этот лектин может использоваться для проведения исследований в биохимии и медицине, а именно, в гистохимических и цитохимических исследованиях, биотехнологии. Цель изобрполучаемого прПоставлен ночистку провод"овомуцин", погликоп ротеидовние проводят хлную хроматогра0,07 М фосфатнСпособ пол"овомуцин" дляван 07.04,90., б етения - повышение чистотыоду кта,ая цель достигается тем, чтоят на аффинном сорбентелученном из нерастворимыхкуриного яйца, высаливаоридом натрия, ионообменфию на ДЭАЭ-целлюлозе вом буфере,учения аффинного сорбентаочистки лектинов опубликоюлл, М 13. А.С, ч. 1554961. акациевой, собранной в период распускания почек 0,9%-ным водным раствором хлорида натрия, высаливания, диализа. аффинной хроматографии на сорбенте "овомукоид", полученном из нерастворимых гликопротеидов белка куриного яйца, элюацию осуществляют 1%-ным раствором уксусной кислоты, высаливанием хлоридом натрия, повторным диализом, очисткой на ДЭАЭ- целлюлозе в 0,07 м фосфатном буферном растворе, затем высаливают хлоридом натрия и лиофилизируют, Положительный эффект заключается в повышении степени очистки, по данным диск-электрофореза лектин представлен двумя близко идущими изоформами. Сущность предлагаемого способа заключается в том, что для очистки используют аффинный сорбент "овомуцин", обладающий более высокой химической и механической прочностью, а также лучшими гидродинамическими свойствами, который к тому же обладает высоким средством к лектину коры ВоЬиа рэецсоасаса 1,П р и м е р, Кору ЯоЬиа рзеобоасасасобирают в момент распускания почек, когда активность лектинов максимальна. 1 кг измельченной коры экстрагируют 0,90, раствором хлорида натрия в соотношении коры к экстрагенту 1:10 на протяжении 1 - 3 часа при непрерывном перемешивании. Полученный экстракт отжимают через плотную ткань и центрифугируют при 2500 9 на протяжении 10 мин. Затем рН раствора доводят до 3,0 и добавляют МаСиз расчета 320 г/л. Осадок собирают центрифугированием 15 мин при 3000 9, Супернатант сливают, а1799599 45 Составитель В,АнтонюкТехред М,Моргентал Корректор Н.Милюкова Редактор С,Кулакова Заказ 1123 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 осадок размешивают в пятикратном количестве воды и рН раствора доводят до 8,0+.0,5. Нерастворившийся осадок отбрасывают,Надосадочную жидкость, полученную на предыдущей стадии, диализируют против 0,1 М фосфатного буферного раствора, рН 7,5+0,5 с 0,5 М натрия хлорида. После диализа наносят на колонну, заполненную аффинным сорбентом, Для очистки лектина, получаемого из 1 кг коры йоЬпа рзеабоасасасобранной в момент распускания почек, достаточно 2,2 й 0,3 л сорбента. Колонку предварительно отмывают от консерванта и уравновешивают 0,1 М фосфатным буферным раствором, рН 7,5+0,5, После нанесения раствора лектина колонку промывают тем же буферным раствором до тех пор, пока светопоглощение при 280 нм не станет ниже 0,05, затем лектин снимают с колонки путем промывки ее 1раствором 20 ацетатной кислоты,Фракции, содержащие лектин, объединяют и белок высаливают при рН 7,0 320 г/л хлоридом натрия, Осадок собирают центрифугированием, затем растворяют в 5-кратном количестве дистиллированной воды и ставят на диализ против 0,07+0,01 М фосфатного буферного раствора, рН 7,0 с не менее, чем с трехкратной сменой растворителя с интервалом в 8 часов. Небольшой осадок, нерастворившийся после диализа, отбрасывают,Отдиализованный раствор лектина наносят на колонку, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой (НПО "Биолар", Олайне),уравновешенную тем же буферным раствором. Объем колонки 50 см . В этих условияхзлектин проходит через колонку без задержки, тогда как пигмент и примесные белки 40при этом задерживаются на колонке.Контроль выхода лектина проводят с помощью реакции гемагглютинации с эритроцитами человека,Фракции, содержащие лектин, объединяют, лектин высаливают хлоридом натрия (320 г/л), осадок растворяют в пятикратном количестве дистиллированной воды и после диализа против воды лиофильно высушивают. Выход - 1,5+0,3 г лектина из 1 кг воздушно-сухой коры, собранной во время распускания почек,Готовый продукт после лиофильной сушки представляет собой белый аморфный порошок, хорошо растворим в 0,9 -ном растворе натрия хлорида, Минимальная концентрация, агглютинирующая эритроциты человека/О/ группы - 0,6 мкг/мл. Лучшим ингибитором активности лектина среди моносахаридов является 2-ацетамидо-дезоксигалактопиранозид (минимальная концентрация, угнетающая активность 4 гемагглютинирующих единиц лектина - 6,25 мМ). По данным диск-электрофореза в полиакриламидном геле, в щелочной буферной системе, рН 8,6 в присутствии 0,1 додецилсульфата натрия, лектин состоит из двух близко идущих изоформ, которые имеют мол,массу 56+2 кД и 60+2 кД.Формула изобретения Способ получения лектина путем экстракции измельченной коры робинии ложноакациевой (РоЬпа рзецбоасаса 1.,) 0,9-ным водным раствором хлористого натрия, высаливания, диализа, аффинной хроматографии, элюции, повторного диализа и высушивания, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения степени чистоты, используют кору робинии ложноакациевой, собранную в период распускания почек, аффинную хроматографию проводят на сорбенте "овомукоид"; полученном из нерастворимых гликопротеидов белка куриного яйца, элюцию осуществляют 1-ным раствором уксусной кислоты, высаливают хлоридом натрия и после диализа очищают на ДЭАЭ- целлюлозе в 0,07 м фосфатном буферном растворе, а перед лигофилизацией повторно высаливают хлоридом натрия.