Способ получения 7-метоксицефалоспори-hob или их солей

Союз Советских Социалистических Республик(51)М, Км,Р С 07 0 501/36 С 12 Р 35/ООЮ А 61 К 31/545 Государственный комитет СССР ио делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Иностранная фирма- СН -Р2О СООМ ИООССИ-(СИСОНИСООМ где й и М имеют укаэанные значения, аэробно воздействуют мицелием микроорганизма рода Тг)цопорз 1 з, продуцирующего окисляющий 0-аминокислоту энзим, или обработанным продуктом мицелия и выделяют целевой продукт в виде свободной кислоты или соли.Примерами азотсодержащей пятиили шестичленной гетероциклической группы служат пиридильная группа, 5-метил (или 5-карбоксиметилтио)Изобретение относится к способу получения цефалоспоринов с метокснльной группой в 7-ом положении, в частности к способу получения цефалоспо-. ринов, имеющих метоксигруппу или4-карбоксибутнрамидную группу в 7-ом положении н гетероциклическую тиометильную группу в 3-ом положении, Ферментацией.10Известен способ получения 3-заме- щенной 7-метокси-(5-амино-карб" оксивалерамидо)-3-цефем-карбоновой кислоты или ее солей культивированием .продуцирующего 7-метоксицефалоспори новый антибиотик микроорганизма в водной культуральной среде в аэробных условиях, введением в образующуюся 7-метокси-(5-амино-.карбоксивалерамидо)-3-(карбамоилоксиметил)- 20 -3-цефем-карбоновой кислоты вводят соответствующий заместитель в положение 3 и выделяют целевой продукт в виде свободной кислоты или соли. Эти соединения обладают физиологически 25 активными свойствами 1).Цель изобретения - получение новых производных цефалоспорина, расширяющих арсенал средств воздействия на живой организм. 30 Поставленная цель достигается способом получения 7-метоксицефалоспоринов Формулы 1 где К - азотсодержащая пяти- или шестичленная гетероциклическая группа,М - атом водорода или катионный остаток, образующий соль, заключающимся в том, что на соединение формулы 11буферного раствора с рН 8,1, содержащего 0,026 азида натрия. 5 ч пеоремешивают при аэрировании и 33 Си после обработки по методике примера 5 б, получают 7-(4-карбоксибутирамидо) -7-метокси- (1-метилН-тетразол-ил) тиометил-цефем,-4-карбоновую кислоту.П р и м е р 11, К раствору 50 мг7-(5-амино-карбоксивалерамидо )-3 - (3-п-оксифенил-метоксипропеноил)-оксиметил-метокси-цефем- о-карбоновой кислоты в 10 мл 0,1 Мпирофосфатного буферного растворас рН 8,1, содержащего 0,026 азиданатрия, прибавляют 0,5 мл суспензиимицелия, полученного из Тг 9 опорьь 15чагаЬ 1 ь по методике примера 5 а,затем смесь обрабатывают, как в примере 5 б, и получают 7-(4-карбоксибутирамидо) -3- (З-п-оксифенил-мет-.оксипропеноил)оксиметил-метокси О-3-цефем-карбоновую кислоту.Полученные Фракции подвергаюттонкослойной хроматографии на Ачсе 1с использованием смеси растворителейизопропанол : н-бутанол : уксуснаякислота ; вода (объемное отношение21:3:7:9) и бутанол ; уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:: 1: 2 ) и собирают Фракции с ЯО, 67и 0,67 соответственно. Время задержки Фракции в скоростной жидкостнойхроматографии 5 мин 55 с применяетсясмесь растворителей. ацетонитрил;:0,1-ный водный раствор уксусной кислоты (объемное отношение 2:8) . Продукт имеет отрицательную реакцию снингидрином,П р и м е р 12. В 10 мл 0,1 Мпирофосфатного буферного раствора,содержащего 0,02 азида натрия, растворяют 54,5 мг 7-(5-амино-карбоксивалерамидо) -7-метокси-(1-метилН-тетразол-ил)тиометил-цефем-карбоновой кислоты. После прибавления 0,5 мл суспензии активированкого мицелия,полученного по методике примера 5 а, смесь перемешивают приаэрировании и 33 С (водяная баня).Окончание реакции определяют по проверке через каждые 30 мин на аппарате скоростной хроматографии Хитачи Ясистема растворителей - ацетонитрнл::0,1-ный раствор уксусной кислоты,объемное отношение 1;9), время задержки исходного соединения 7-(5-ами 55но-карбоксивалерамидо)-7-метоксив (1-метилН-тетразол-ил)-тиометил-3-цефем-карбоновой кислоты 1 м1 мин 53 с, а время задержки 7-(4-карбоксибутирамидо)-7-метоксив (1 -метилН-тетразол-ил)тиометил-цефем-карбоновой кислоты, получаемой путем окисления Э-аминокислоты, 4 мин 54 с. По окончании реакциимицелий отделяют центрифугированиемопри 4 С. Верхний слой отделяют, доводят до рН 1,5-2,0 с помощью разбав ленного водного раствора соляной кислоты и четыре раза экстрагируют равными объемами этилацетата. Экстракты в этилацетате соединяют и снова экстрагируют фосфатным буферным раствором с рН 6,0, эту вытяжку доводят до рН 1,5-2,0 с помощью разбавленного раствора соляной кислоты, а затем экстрагируют снова четыре раза равными объемами этилацетата. Объединенные экстракты в этилацетате сушат безводным сульфатом натрия и упаривают досуха, Остаток разделяют на колонке с микрокристаллической целлюлозой Ачсе 1, применяя смесь растворителей н-бутанол: уксусная кислота: :вода (объемное отношение 4:1:2), Проверяют антимикробное действие каждой фракции по отношению к Ргосець агаЬ 1 ь и отбирают фракции, обладающие активностью по отношению к этим микроорганизмам, подвергают их тонкослойной хроматографии на Ач 1- се 1 5 Е, используя смесь растворителей изопропанол : бутанол : уксусная кислота : вода (21:3:7:9) и смесь бутанол : уксусная кислота : вода (4:1:2). Собирают фракции, обладающие абсорбцией в ультрафиолетовой области света 2536 .А %0,81 и 0,64 соответственно. Эти фракции соединяют, концентрируют и лиофилйзируют, в результате чего получают 35 мг чистой 7-(4-карбоксибутирамидо)-7-метокси- -3- (1-метилП-тетразол-ил)тиометил-цефем-карбоновой кислоты.П р и м е р 13, В 10 мл хлороФорма суспендируют 100 мг 7-(4-карбоксибутирамидо)-7-метокси-(1-метил- -1 Н-тетразол-ил) тиометил-цефем- -4-карбоновой кислоты, к суспензии прибавляют 4 мл 1-ного раствора диазометана в эфире, после чего 30 мин перемешивают прн комнатной температуре. Полученную реакционную смесь промывают разбавленной уксусной кислотой и водой, сушат безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток подвергают колоночной хроматографии, с применением силикагеля и смеси растворителей бензол ; этилацетат (объемное отношение 1:3). Требуемые Фракции собирают, концентрируют при пониженном давлении и получают 80 мг метилового эфира 7-метокси-(4-метоксикарбонилбутирамидо)-3-(1-метил- -1 Н-тетразол-ил)тиометил-цефем- -4-карбоновой кислоты.ИК-спектрКВг см " 1760 (лактам О:С )1725 (сложный эфир,карбонил).П р и и е р 14. В 10 мл 0,1 М пирофосфатного буферного растворас рН 8,1, содержащего 0,026 азида натрия, растворяют 50 мг 7-(5-амико -5-карбоксивалерамидо)-7-метоки- в (5-метил,3,4-тиадиазол- ия)тио"метил-цефем-карбононой кислотыи, после прибавления к раствору0,5 мл суспензии мицелия, приготонленного, как в примере 1 а, из штамма Тг 19 опорьь чаг 1 аЬ 11 ь 1 ГО 0755смесь перемешивают при аэриронаниии нагревании на водяной бане с температурой 33 фС для окисления 0-аминокислоты. Окончание реакции определяется по методу скоростной жидкостной хроматографии, описанномун примере 5 б. Время задержки исходного продукта .7-(5-амино-карбоксивалерамидо)-7-метокси-(5-метил"-тиадиазол-ил) тиометил-цефем-карбононой кислоты, получаемойпутем окисления Э-аминокислоты,11 мин 18 с. 20По окончании реакции мицелий отделяют при 4 оС, нерхний слой собирают, доводят разбавленным раствором соляной кислоты в воде до рН1,5-2,0 и четыре раза экстрагируютравными объемами этилацетата, Экст- .ракты в этилацетате соединяют и сноваэкстрагируют буферным раствором Фосфата с рН 6,0, экстракт доводят дорН 1,5-2,0 и повторно экстрагируютчетыре раза равными объемами этилаце- З 0тата. Экстракты в этилацетате соединяют, сушат безводным сульфатом натрия и упаривают досуха. Продукт разделяют на колонке с микрокристаллической целлюлозой, используя смесь 35растворителей н-бутанол : уксуснаякислота : вода (объемное отношение4:1:2), как для растворенного продукта, так и для самой колонки. После этого Фракции, обладающие антимикробной активностью по отношениюк Ргосець щ 1 гаЬ 111 а, собирают, подвергают тонкослойной хроматографиина пластинах с Ач 1 се 1 5 Г и разделяют,используя смеси растворителей иэопропанол : бутанол : уксусная кислота ; вода (объемное отношение 21".3::2), для получения фракций, отвеча"ющих поглощению света в упьтрафиоле- а 0тоной части спектра 2536 Ъ по прибору Манасулу (фирмы Манасулу КагакуКогио К.К.) и Р 0,82 и 0,77 соответственно. Полученные фракции соединяют, концентрируют, лиофилизуют 55и получают 32 мг чистой 7-(4-карбоксибутирамидо) -7-метокси-(5-метил,3,4-тиадиазол-ил)тиометил-цефем-карбононой кислоты.П р и м е р 15. В 5 мл буферного 60растнора 0,1 М пнрофосфата (рН 8,1).,содержащего 0,026 азида натрия,растноряют 25 мг 7-(5-амино- карбоксиналерамидо)-3-(5-карбоксиметилтио,3,4-тиалиазол-ил) тиометил- 45-метокси-цефем-карбоновой кислоты и после добавления к раствору0,5 мл суспензии активированного мицелия, приготовленной как в примере 5 а, смесь перемешивают при аэрировании и нагревании на водяной банепри 33 С для окисления В-аминокислоты. Течение процесса проверяют каждые 30 мин по скоростной хроматографии методом Хитачи, так же, как этопроизводится в примере 5 а, с цельюопределения окончания реакции. Приэтом время задержки исходного соединейия,7-(5-амино-карбоксивалерамидо)-3-(5-карбоксиметилтио,3,4-тиадиазол-ил)тиометил-метокси-цефем-карбоновой кислоты 3 мин 14 с,а вещества, полученного окислениемр-аминокислоты-(4-карбоксибутирамидо) -3-(5-карбоксиметилтио,3,4-тиадиазол-ил)тиометил-метокси-цефем-карбоновой кислоты13 мин 24 с.По окончании реакции мицелий удаоляют центрифугированием при 4 С, отделяют верхний слой, доводят его дорН до 1,5-2,0 с помощью разбавленного водного раствора соляной кислотыи экстрагируют четыре раза равнымиобъемами этилацетата. Соединенныеэкстракты в этилацетате снова экстрагируют буферным фосфатным раствором, имеющим рН 6,0, Экстракт, в котором доводят рН до 1,5-2,0 с помощьюразбавленного водного раствора соляной кислоты, снова экстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата.Последний экстракт соединяют и сушатсульфатом натрия, а затем упариваютн вакууме досуха.Концентрат разделяют, используясмесь растворителей бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2) на колонке с микрокристаллической целлюлозой (А - торговаямарка) и пользуясь тем же составомрастворителей.Проверяя антимикробную активно:тькаждой фракции, отбирают те фракции,которые обладают активностью по отношению к Ргосецв в 1 гаЬ 111 а, и подвергают их тонкослойной хроматографиина Ач 1 се 1 5 Г, применяя растворителиизопропанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 21:3:7:9) исмесь бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2 ), длясоответстнующего отбора Фракций,обладающих поглощением н ультрафиолетовой части спектра 2536 А на приборе Манасулу и % 0,79 и 0,72 соответственно. Эти фракции концентрируют, лиофилизуют и получают 16 мгчистой 7- (4-карбоксибутирамидо)-3 в (5-карбоксиметилтио,3,4-тиадиазол-ил)тиометнл-метокси-цефем-карбононой кислоты,П р и м е р 16. В 10 мл 0,1 Мпирофосфатного буферного раствора, 2479966823рН 8,1, содержащего 0,026 азиданатрия, растворяют 50 мг 7-(5-амино-карбоксивалерамидо)-7-метокси-(1,3,4-тиадиазол-ил)тиометил-цефем-карбоновой кислоты, прибавляют к нему 0,5 мл суспензии,полученной с мицелием Тг 1 допорььчагаЬ 11 ь, согласно методике примера 5 а, смесь перемешивают приаэрировании на водяной бане при33 С, осуществляя окисление Э-аминокислоты. Окончание реакции определяют с помощью того же метода,что в примере 5 б. Время задержки исходного продукта в скоростной жидкостной хроматографии 7-(5-амино-карбоксивалерамидо)"7-метокси-З-(1,3,4- 15-тиадиазол-ил)-тиометил-цефем-карбоновой кислоты 1 мин 56 с, а7- 14-карбоксибутирамидо) -7-метокси-1,3,4-тиадиазол-ил) тиометил-цефем-карбоновой кислоты, полу Оченной при окислении 3)-аминокислоты, 5 мин 28 с.По окончании реакции мицелий удаляют при 4 оС, верхний слой собирают,значение его РН доводят с помощьюразбавленного водного раствора соля-,ной кислоты до 1,5-2,0 и экстрагируютчетыре раза равными объемами этилацетата, Соединенные этилацетатные экстракты экстрагируют буферным раствором фосфата, имеющим РН 6,0, а этот 3 фраствор снова экстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата, экстракты соединяют, сушат безводнымсульфатом натрия и упаривают в вакууме досуха, 33Полученный продукт разделяют, при -меняя смесь растворителей бутанолуксусная кислота ; вода (объемноеотношение 4:1:2) и колонку, наполненную микрокристаллической целлюлозойи смесью растворителей такого же состава. При этом отбирают Фракции, обладающие антимикробной активностью поотношению к Ргосець а 1 гаЬ 1 ь. Этифрак;:и подвергают тонкослойной хроматографии иа Ачсе 1 5 Г и проявляютсмесью растворителей изопропанол : бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 21;3:7:2) и бутанол : уксусная кислота : вода (объ- Щемное отношение 4:1:2), собирая фракции с поглощением в ультрафиолетовойчасти спектра 2536 А на приборе Манасулу и % с 0,81 и 0,65 соответственно,Собранные Фракции концентрируют, лиофилизуют и получают 40 мг чистой7-(4-карбоксибутирамидо) -7-метокси-(1,3,4-тиадиазол-ил)тиометил-З-цефем-карбоновой кислоты,П р и м е р 17 В 10 мл 0,1 Мпирофосфатного буферного раствора сРН 8,1, содержащего 0,026 азиданатрия, растворяют 50 мг 7-(5-амино-карбоксивалерамидо)-7-метокси-(1,3,4-тиадиазол-ил)тиометил-З- д-цефем-карбоновой кислоты, после того, как к раствору прибавят 0,5 мл суспензии активированного мицелия, приготовленной на Тг 9 опорьь чаг 1- аЬ 1 ь, таким же путем, как и в примере 5 а. Смесь перемешивают при аэрировании и нагревании на водяной бане при 33 С для окислениями) -аминокисолоты. Окончание реакции определяют по методу скоростной жидкостной хроматографии. Время задержки исходного материала - 7-(5-амино-карбоксивалерамидо) -7-метокси-З-(1,3,4-тиадиазол-ил)тиометил-цефем-карбоновой кислоты 1 мин 56 с, а полученного при окислении 2-аминокислоты 5 мин 28 с.По окончании реакции мицелий удаляют при 4 С, а верхний слой отдееляют, разбавленным раствором соляной кислоты в воде доводят его до РН до 1,5-2,0 и четыре раза экстрагируют равными объемами этилацетата, экстракты соединяют и снова экстрагируют буферным раствором Фосфата с РН 6,0. Эти экстракты доводят до РН 1,5-2,0 и повторно экстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата, после соединения которых их сушат безводным сульфатом натрия и упаривают досуха в вакууме. Продукт разделяют, приме няя смесь растворителей бутанол : ук- сусная кислота ; вода (объемное отношение 4:1;2) и колонку, наполненную микрокристаллической целлюлозной Ачсе и смоченную той же смесью растворителей. При этом отбирают фракции, обладающие антимикробной активностью по отношению к Ргосеоь агаЬ 1 ь, Эти фракции подвергают тонкослойной хроматографии на Ач 1- се 1 5 Р, применяя смеси растворителей изопропанол : бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 21:3:7:9) и бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2) соответственно, и собирают фракции, обладающие поглощением света в ультрафиолетовой части спектра света 2536 Х на приборе Манасулу. Фракции концентрируют, лиофилизуют и получают 40 мг чистой 7-(3-карбоксибутирамидо)-7-метокси- -3-(1,3,4-тиадиазол-ил) тиометил- -3-цефем-карбоновой кислоты. Формула изобретенияспоСпособ получения 7-метоксицеф алоринов или нх солей Формулы 1сн,НООС-(СН,),-СО)НМОСН 25-ЯСООМгде- азотсодержащая пяти- или шестичленная гетероциклическая группа,25 26 799668 Составитель Э. ЛатыповаРедактор Г. Кацалап Тех ед Н.Бабурка Ко екто И. М ска Заказ 10107/88 Тираж 454 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, ЖРаушская наб. д. 4 5Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 М - атом водорода или катионныйостаток, образующий соль,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,на соединение формулы П где й и И имеют укаэанные значения,аэробно воздействуют мицелием микроорганизма рода Тгдопорьз, продуцирующего окисляющий 3-аминокислотуэнэим, или обработанным продуктоммицелия и выделяют целевой продуктв виде свободной кислоты или ее соли.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Патент ВеликобританииМ 1321412, кл. С 2 А, опублик. 1973.-1,3,4-тиадиазол-ил и 1,3,4-тиадиазол-ил или 1-метилтетразол-ил.Катионный остаток М для образования соли цефалоспорина означает неорганический или органический остаток, Примерами неорганического остатка служат щелочные металлы (натрий и калий), щелочноземельные металлы (кальций, магний и барий), тяжелые металлы (железо, медь и цинк) . Примерами органического остатка служат основания, образующие четвертичные соли, как соли аминов триэтиламин, диэтаноламин, пиперидин и морфолин),Штамм рода Тгдоктореь выбирают из типовой культуры или выделяют из почвы. Для увеличения активности об разования вещества формулы 1 можно применять мутанты, получаемые из указанных штаммов. В качестве микроорганизма, обладающего активностью энзимного окисления О-аминокислоты, можно ;щ указать на Тгдопорь(ь чаг(аЬ(ь.Для получения вещества 1 с помощью микроорганизма, имеющего энзимную активность по окислению О-аминокислоты, предпочтительно микроорганизм сначала культивировать, а полученный мицелий или обработанный мицелий подвергать взаимодействию с цефалоспориновым соединением формулы 11, В качестве мето.- да культивирования с получением мицелия обычно применяют аэробное куль- Ю тивирование, еще лучше применять жидкое культивирование при перемешивании и прн аэрации. В этом процессе применяют обычную культуральную среду. Можно применять искусственную, полуис кусственную или природную культуральные среды. В качестве источника углерода в такой среде применяют глюкозу, сахарозу, манитол, глицерин, декстрин, крахмал и растительное масло, в качестве источника азота применяют мясной экстракт, пептон, глютеновую муку, муку из хлопковых семян, соевую муку, арахисовую муку, рыбную муку, кукурузную барду, сухие дрожжи, дрожжевой экстракт, сульфат аммония, ф. нитрат аммония, мочевину и другие органические или неорганические азот- содержащие соединения.При необходимости в культуральную среду добавляют металлические со-, 6 ли (сульфаты, нитраты, хлориды, карбонаты, фосфаты натрия, калия, магния, кальция, цинка и железа). Кроме того, при необходимости в культуральную среду добавляют метионин., 55 цистеин, цистин, метилолеат, силиконовое масло, поверхностно-активное вещество в качестве промотора образования или противовспенивателя.Хорошие результаты получают при рН культуральной среды около 4-10, лучше 5-6. В частности, если в культуральной среде содержится О-(или О-)- аминокислота; например О-(или О-)ме тионин, О-(или 0(.-)эланин, 0-(или О(. -) валин, то достигается высокая активность энзима, окисляющего О-аминокислоту. Температура культивирования обычно составляет 18-37 С, лучше около 30 С. Длительность культивирования меняется в зависимости от условий культивирования, в частности используемого аппарата для культивирования, состава культуральной среды,температуры культивирования, но предпочтительно заканчивать культивирование, когда активность окисляющего О-аминокислоту энзима становится максимальной. Обычно для этого требуется2-10 дней.Полученный таким образом мицелий или обработанный мицелий применяют для окислительной реакции 0-аминокислоты в исходном веществе формулы 11, Обработанный мнцелий означает мицелий, который превращен в форму для продуцирования вещества 1 путем увеличения активности окисляющегоЭ-аминокислоту энзима применением егосоответствующей обработки.Например, активно окисляющий Э-аминокислоту энзим обычно существует в мицелии, и обработанный мицелий означает освобожденный от клетокэкстракт, с помощью физической илихимической обработки мицелия, собранный из продукта культивирования штамма, продуцирующего окисляющий 2-аминокислоту энзим. Промывают и частично или полностью очищают окисляющий Э-аминокислоту энзим, полученный из несодержащих клеток экстракта путем применения методов разделения иочистки энзимов, активированный мицелий, полученный комбинацией частичноили полностью очищенного окисляющего 0-аминокислоту энзима, соединяют с водонерастворимым полимером или неорганическим носителем физическим или химическим методом и получают твердый активатор окисляющего 2-аминокислоту энзима или мицелия, затем активатор или мицелий подвергают активирующей обработке.Получение и циркуляция указанногорастворимого энзима практически ограничены, но применение нерастворимого энзнма, например активированного мицелия, удобно для промышленного применения, поскольку его можно легко выделить и применять повторно,Активирующую обработку мицелияпроводят путем нанесения мицелию слабого повреждения в такой степени, чтобы его не разрушить, Примером такой активирующей обработки служат:метод, по которому мицелий замораживают до температуры ниже -10 С при рН около 3-4, затем размораживают;метод, по которому мицелий обрабатывают в ванне одним или несколькими органическими растворителями, например ацетоном, бутанолом, 2-фенилэтанолом, диэтиловым эфиром, толуолом;метод, по которому мицелий обрабатывают 0,1-10-ным раствором по-. верхностно-активного вещества, например катионным поверхностно-активным веществом (цетилтриметиламмонием, цетилпиридинием, цетилдиметилбензиламмоний галоидом), анионным поверхностно-активным веществом (додецилсульфатом, алкиларилсульфонатом щелочного металла, деэоксихолатом натрия) или неионным поверхностно- активным веществом (монолауратом сорбитана, тритоном Хв .его водном растворе);метод, по которому мицелий обра батывают разбавлЕнным водным раствором гидроокиси калия или гидроокиси натрия нметод, по которому мицелий суспендируют в растворе с большим осмоти- щ ческим давлением, например 2 М растворе сахара, а затем раствор быстро разбавляют водой.На такую активирующую обработку сильно влияют разные факторы (напри 25 мер, температура, длительность обработки, величина рН, концентрация реа. гента и другие), следовательно, необходимо подбирать условия активацииКроме того, когда действие ката лазы, обычно присутствующей в мицелии, не ингибируется, то окислительное декарбоксилирование в конечный продукт 1 становится неполным с образованием одновременно 7-(5-карбок си-оксовалерамидо) -7-метоксицефало спорннового производного, представленного общей формулой 111 40 7-(5-амино-карбоксивалерамидо)- -3-(5-карбоксиметилтио,3,4-тиадиазол"2-ил)-тиометил-метокси-цефем-карбоновая кислота (А);7"(5-амнно-карбоксивалерамкдо) - -3-(1-метилН-тетразол-ил)-тиометил-метокси-цефем-карбоновая кислота (В);7-(5-амино-карбоксивалерамидо) - -7-метокси-(5-метил,3,4 -тиадиаэол-ил)-тиометил-цефем-карбоновая кислота (С) и7-(5-амино-карбоксивалерамидо) - -7-метокси-(1,3,4-тиадиаэол-ил)- -тиометнл-цефем-карбоновая кислота (О).Примеры 7-метоксицефалоспорнновых производных формулы (1), полученных ОСН, НООС-СО-(СНСОИН й, Сн 25%СООН Для селективного получения вещества 1 желательно ингибировать актив ность каталазы, Примерами соответствующих ингибиторов каталыэы служат аскорбиновая кислота, З-амино,2,4- -триазол, азид щелочного металла (лучше аэид натрия). Ингибитор можно 5 О добавлять в реакционную смесь во время превращения исходного вещества 11 в вещество 1, или мицелий можно предварительно обработать ингибитором перед применением, Количество азида натрия для этой цели составляет 1- 100 мм.Кроме того, каталазу в мнцелии можно деэактивировать термообработкой мицелия до использования его в стадии превращения, При обработке 4 ф мицелия при 40-60 С (лучше при 50 С) в течение не менее 3 ч значительно снижается активность каталаэы, но активность Т)-аминокислотной оксидазы сохраняется. Термообработку мицелия 5 можно осуществлять в водном растворе или в буферной суспенэии. Особенно эффективно применять одновременную термообработку и обработку активирующим реагентом. Например, проводя активирующую обработку мицелия при 50 С в течение 4 ч с применением такого растворителя, как толуол, одновременно удается ингибировать каталазу и активировать мицелий.Реакцию энзимной смеси активированного мицелия и исходного вещества (2 ) обычно ведут при рН 6-8. Желательно проводить реакцию при 30.40 С. Длительность реакции зависит, главным образом, от активности энэима, но обычно она составляет 1-5 ч.Энэимная реакция проводится в аэробных условиях,. т,е. при аэрации воздухом или кислородом.Выделение продукта Формулы 1 можно вести при соответствующих условиях из Ферментированного бульона исходного вещества формулы 1 Т после удаления из него мицелия, т.е. образовавшееся вещество 1 можно легко выделить экстракцией растворителем или сорбцией ионообменной смолой. Например, реакционную продуктовую смесь подкисляют до рН2,5, затем нужное вещество экстрагируют иэ этой смеси соответствующим органическим растворителем (этилацетатом, бутилацетатом, бутанолом). В этом случае лучшие результаты дает комбинация ионообменной смолы и экстракции растворителем, Соответствующюеи ионообменными смолами являются жидкие аминовые аннонообменные смолы. Целевой продукт можно также выделить с помощью твердой ионообменной смолы. В этом случае хороший растворитель можно выбрать путем предварительного опыта.Целевое вещество формулы 1 можно выделять не только в виде свободной кислоты, но и в виде его соли щелочного или щелочноземельного металла, соли органического амина.Примеры исходных соединений формулы 1:предлагаемым способом, и их свойства.П р и м е р 1. 7-(4-Карбоксибутирамидо)-3-(5-карбоксиметилтио- -1,3,4-тиадиазол-ил)-тиометил- -метокси-цефем-карбоновая кислота (ОСНЛООС-(СН,),СОНН+-(И-Н05 5 СН СООНСООИИсходное соединение А Формулы=) в55-СНСООН; М=Н.Физические и химические свойства.Белый порошок, т.пл. 75"78 С. Легко растворим в метаноле и этаноле,растворим в воде, этилацетате, бутил"ацетате и бутаноле, плохо растворимВ других органических растворителях.Кислое вещество, дает отрицательнуюнингидриновую реакцию. Для УФ-спектрапоглощения при определении в Фосфорном буферном растворе 0,01 М ирН 6,5 максимум поглощения при,278 ммк. ИК-спектр поглощения (приопределении в виде таблетки КВг)при 3250, 2925, 1770, 1715, 1520 фи 1380 см 1. ЯМР-спектр, определенныйв ТМ 5 в качестве внутреннего стандарта в тяжелом метаноле, дает сигналывеличина е (части/млн) 1,93 (2 Н,мультиплет); 2,41 (4 Н, мультиплет);3,1 (ЗН, синглет); 3,37-3,81 (2 Н,квартет, 3 18 Гц); 4,11 (2 Н, синглет); 4,15-4,63 (2 Н, квартет,3 14 Гц); 5,05 (1 Н, синглет).Элементный анализ для С Н И 0 52 Н,О.Вычислено,Ъ: С 35,99; Н 4,03;й 9,33,Найдено,%: С 35,77; Н 3,81;М 9) 2.Масс-спектр, определенный послегндролиза вещества б н.соляной кислотой в течение 2,5 ч при 100 О С,экстракции продукта этиловым эфиром,сушки продукта испарением и силилирования бис-триметилсилилацетамидом(БСА), дает фрагмент при м/е 276(СНЗ)= Ы - ООС - (СН) -СОО( Ь,СН) .Конечное соединение представляет собой 7-метоксицефалоспориновоесоединение, исходя из наличия, вчастности, линий поглощения при1770 см "(циклический лактам) в инФракрасном спектре поглощения и изсигнаЛов 3,5 (ЗН, синглет, 7-ОСНЗ);5,05 (1 Н, синглет, б-СН); 3,37-3,81(2 Н, квартет, 3 18 Гц, 2-СН); 4,154,6 (2 Н, квартет, 3 14 Гц, 3 - боковая цепь СН) и 4,11 имп/мин (2 Н,синглет, СНцепи -5-СН-СООН).Крометого, имеются сигналы 1,93 (2 Н, мультиплет, -СН) и 2,41 имп/мин (4 Н,мультиплет, (,-СН); показывающие наличие 4-карбоксибутирамидо вспектре ЯМР, и масс-спектр производного данного целевого соединения, которое гидролизуется соляной кислотойи силилируется, дает фрагмент м/е276, поэтому конечное соединение (1)имеет указанную структуру, т.е.5-амино-карбоксивалерамидогруппа в.7-ом положении исходного соединенияподвергнута окислительному дезаминированию до 4-карбоксибутирамидогруппы.15 П р и м е р 2. 7-(4-Карбоксибутирамидо)-7-метокси-(1-метилН-тетразол-ил)-тиометил-цефем-карбоновая кислотаОСНРо ИООС-(СН,-СОНН- 91И 1 СН.,г аОООН НффСН,Исходное соединение В фоН-йгде р,. 1 ц:цСйъФизические и химические свойства.Белый порошок, т,пл. 80-83 С. Легко растворим в метаноле и этаноле,растворим в воде, этилацетате, бутилацетате и бутаноле, плохо растворимв других органических растворителях;З натриевая соль легко растворима в воде. Кислое вещество, дает отрицательную нингидриновую реакцию. Для УФспектра в Фосфатном буферном растворе 0,01 М с рН 6,5 максимум поглощения при 269 ммк, ИК-спектр определяют4 О в виде таблетки КВг при 3420, 2940,1765, 1680, 1610, 1525 и 1390 смЯМР-спектр, определенный в ТМ 5 в качестве внутреннего стандарта в тяжелом метаноле, дает сигналы; величина45 Ю (части/млн) 1,94 (21, мультиплет);2,40 (4 Н, мультиплет); 3,51 (ЗН, синглет);3,40-3,83 (2 Н, квартет, д 18 Гц);3,99 (ЗН, синглет);4,17-4,50 (2 Н, квартет, 3 14 Гц); 5,02 (1 Н, синглет),ур Элементный анализ для С Н Н 0752 Н 10,Вычислено,%: С 37,79; Н 4,76,К 16,53.Найдено,Ъ; С 37,78, Н 4,75;й 16,41,Масс-спектр, определенный послегидролиза вещества б н,соляной кислотой в течение 2,5 ч при 100 С, экстрагирования гидролизованного продуктаэтиловым эфиром, сушки испарением иеО силилирования БСА дает фрагмент прим/е 276соединение, исходя, в частности, изналичия линии поглощения при 1765 см1 циклический лактам) в инфракрасномспектре поглощения и из сигналов 3,51(ЗН, синглет, 7-ОСНОВ);5,02 (1 Н, синглет, б-СН); 3,99 (ЗН, синглет,7-ОСНЗ );5,02 (1 Н, синглет, 6-СН);3,99 (ЗН, синглет, й-СН тетразола);3,40-3,83 (2 Н, квартет, Х 18 Гц,2-СН 1) и 4,17-4,50 имп/мин (2 Н,квартет, У 14 Гц, 3 вбоковая цепьСН 1).Кроме того имеются сигналы 1,94/мин (,4 Н, мультиплет, д., -СН 2), показывающие наличие 4-карбоксибутирамидо в спектре ЯМР, и масс-спектрпроизводного данного целевого соединения, гидролизованного солянойкислотой и силилированного, даетфрагмент м/е 276, поэтому конечноесоединение имеет указанную структуру, т.е. 5-амино-карбоксивалер- Щамидогруппа в 7-ом положении исходного соединения подвергнута окислительному дезаминированию до 4-карбоксибутирамидогруппы.-1,3,4-тиадиазол-ил)-тиометил-цефем-карбоновая кислоты (111)Исходное соединение С формулы 1,Н - илСНзфизические и химические свойства.Белый порошок, т,пл. 95-99 С. Легко растворим в метаноле и этаноле,растворим в воде, этилацетате, бутилацетате и бутаноле, плохо растворимв других органических растворителях.Кислое вещество, дает отрицательнуюнингидриновую реакцию. Для Уф-спектра в фосфатном буферном растворе0,01 М при рН 6,5 максимум поглощенияпри 273 ммк, ИК-спектр определяютв виде таблеток КВг пи 3260, 2925,1773, 1515 и 1375 см .ЯЯМР-спектр, определенный в качестве внутреннего стандарта в тяжелом метаноле, дает сигналы: величина д (части/млн); 1,92 (2 Н, мультиплет); 2,40 (4 Н, мультиплет); 2,71(ЗН, синглет);3,38-3,80 (2 Н, квартет, Э 18 Гц), 3,51 (ЗН, синглет),4,17-4,64 (2 Н, квартет, Э 14 Гц) и5,03 имп/мин (1 Н, синглет).Элементный анализ для С 17 Н 20 й 4075Вычислено,Ъ: С 41,79, Н 4,1; .ЙОй 11,47,Найдено,Ъ: С 41,89 Н 4,27;й 11,17.Масс-спектр, определенный послегидролиза вещества б н. соляной кис лотой при 100 С в течение 2,5 ч, экстрагирования продукта этиловым эфиром, сушки экстракта испарением и силилирования БСА дает фрагмент при м/е 276СНЗ )3 5ООС СН 2 СН 2 СН 2 СОО(СИЗ)3.П р и м е р 4. 7-(4-Карбоксибутирамидо)-7-метокси-З-(1,3,4-тиадиазол-ил)-тиометил-цефем-карбоновая кислота (1 Ч)ОСИНООС (СН 2) СОМН 1 й йй - С.0 СООНИсходное соединение 0 Формулы 1й - йгде р:4, 1)И = Н.физические и химические свойства.Белый порошок, т.пл, .88-92 С.Легко растворим в метаноле и этаноле; растворим в воде, этилацетате,бутилацетате и бутаноле; ограниченнорастворим в других органических растворителях. Кислое вещество, дает отрицательную нингидриновую реакцию.Уф-спектр при определении в фосфатном буферном растворе 0,01 М прирН 6,5 дает максимум поглощения при274 ммк ИК-спектр определяют в видетаблетки КВг при 3250, 2925, 1770,1515 и 1365 смЯМР-спектр, определенный в ТМ 5в качестве внутреннего стандарта втяжелом метаноле, дает сигналы: величина д (части/млн ) 1,92 (2 Н, мультиплет); 2,40 (4 Н, мультиплет); 3,39,3,83 (2 Н, квартет, Э 18 Гц ); 3,51(ЗН, синглет); 4,24-4,73 (2 Н, квартетЭ 14 Гц); 5,03 (1 Н, синглет) и9,35 имп/мин (1 Н, синглет).Элементный анализ для С Н 1 й О 50,5 НО.Вычислено,В: С 3,74; Н 3,96;й 11,59.Найдено,В: С 39,69; Н 3,87;й 11,.32,Масс-спектр, определенный послегидролиза соединения б н.солянойкислотой в течение 2,5 ч при 100 С,экстрагирования продукта этиловымэфиром, сушки экстракта испарениеми силилированием его БСА дает фрагмент при м/е 276(СН)Ъ 5ООС СНХСН 2 СНа СОО (СНЗ)ЗКонечное соединение представляетсобой 7-метокснцефалоспориновое соединение исходя, в частности, из наличия линии поглощения при 1770 см12 799668 Таблица 2 Соединение Время удерживания Исходное соединение А 3 мин 14 с Сое Целевое соединение 1 3 мин 24 с сходное соединие В мин 53 Исходное соединение А Целевое совдинение 11 0,44 0,3 4 мин 54 елевое соединеие 1 ине 2 мин 55 сходноие С 79 0,72 соединеИсход ние В Целевое соние П 1Исходное сние РЦе не 4 0,34 + 1 мин 18 с един едине Целево ние 11 мин 5 0,6 левое соединеЧ Исходиние С инемин 28 с 0,42 0,44 оедин Целевое ние 111 Исходно ние О 82 0,7742 0,36 + един елевое соединеие ЕЧ 5 мин 18 сксибутир(3-и-окситокси- -оксиетоксиарбоноа 5 мин 55 0,66 0,67 7- (4-карбок бутирамидо)-3- -оксифенил-м оксипропеноил ) метился-меток -цефем-карбо кислота и 3-ит- оксииовая 67 0,67 пяти мышейпутем внутрклеток Е.часа вводят цепи СНа). Кроме того, имеются сигналы 1,92 (2 Н, мультиплет, -СН 2);и 2,40 имп/мин (4 Н, мультиплет, Ы., )-СН), показывающие наличие 4-карбоксибутирамидо в спектре ЯМР, и масс- спектр производного,.полученного путем гидролиэа конечного соединения соляной кислотой и силилирования продукта, дает фрагмент м/е 276, конечное соединение имеет указанную структуру, т.е. 5-амино-карбоксивалерамидогруппа в 7-ом положении исходного соединения подвергнута окислительному дезаминированию до 4-карбоксибутирамидогруппы.В табл. 1 представлены результаты анализа соединений 1-Ч и А-О тонкослойной хроматографией..Т а б л и ц а 1 7-(5-амино-кар оксивалерамидо)-3- - ИЗ-и-оксифенил- -2-метоксипропеноил )-оксиметил 3-7- -метокси-цефем- -4-карбоновая кис- лота П р и м е ч а н и е. Разделительные системы растворителей: 1-Изопропанод:бутанол:уксусная кислота:вода (21;3;7:9 по объему). 2-Бутанол;уксусная кислота;вода (4:1:2 по объему).Определение проводят при помощи нингидриновой реакции, ультрафиолетового поглощения 2536 А или биоавтографии (применяют Ргосеоь а(- ГдЬ 115),Все соединения дают положительный результат в двух последних пробах.Результаты высокоскоростной жидкостной хроматографии приведены в табл. 2. 7-(5-амино-карбоксивалерамидо) -3-.-Г(3-и-оксифенил- -метоксипропеноил)- -оксиметил 3-7-метокси-цефем-карбоновая кислота П р и м е ч а н и е. Система 5 растворителей ацетонитрил: 0,1-науксусная кислота (1:9 по объему); рН 3,3. Для двух последних цефалоспориновых соединений отношение 2: инений В, С, 11 и 11 (чо определяют следую Действие соедв условиях (и чщим образом.В организм эдорогсамцов вида Оду вводбрюшийной инъекции 1со) йНУ, и через дТаблица 3 н и 20 0 0 100 10 100 100 с 0 0 0 0 100 0 40 2 ав. 40е45505 60 путем подкожной инъекции каждое соединение и определяют процент выживания после пяти дней. Аналогичные эксперименты осуществляют с вводом 10 клеток Ргосеоь а 1 гаЬ 111 ь 1287, Каждая контрольная группа включает 10 мышей. Результаты представлены в табл. 3. Пример 5.а) В эрленмейеровские колбы объемом 500 мл помещают по 100 мл культуральной среды, содержащей (рН 6,0)20 г глюкозы, 4 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 1 г сульфата магния, 0,5 г хлористого кальция, 0,1 гборной кислоты, 0,04 г молибдатааммония, 0,04 г сульфата марганца,0,04 г сульфата цинка, 0,045 г сульфата меди, 0,025 г сульфата железа(1), 20 мкг биотина, 2 мг хлоргидрата тиамина, 1 г О-метионина и1000 мл воды. После стерилизации накаждую порцию среды производят посевштамма 1 ГО 0755 Тг 1 допорь 1 в чаг 1 аЬ 111 з и проводят культивирование при30 С в течение 72 ч.По окончании культивирования получают около 1000 мл бульонной культуры, которую подвергают центрифугированию при 4 С и 2000 об/мин в течени30 мин, собирают мицелий и суспендируют его в 500 мл буферного растворас рН 8,1, содержащего 0,1 М пирофосфата; к полученной суспензии мицелияприбавляют 5 мл Тг 1 опа Хи, сцелью активирования мицелия, в течение 20-40 мин взбалтывают смесь при37 С, снова центрифугируют при 4 Сои 2000 об/мин в течение 30 мин,отделенный активированный дважды мицелий промывают буферным растворомпирофосфата с рН 7-8, снова суспендируют в 100-200 мл буферного раствора с рН 8,1, содержащего 0,1 Мпирофосфата, получая суспензию активированного мицелия,б) В 10 мл 0,1 М пирофосфатногобуферного раствора с рН 8,1, содержащего 0,026 азида натрия, растворяют 54,5 мг 7-(5-амино-карбоксивалерамидо)-7-метокси-(1-метилН-тетразол-ил) тиометил-З-це. фем-карбоновой кислоты и, после прибавления к этому .раствору 0,5 мл суспензии активированного мицелия, производят перемешивание его в условиях аэрирования на водяной бане с температурой 33 С. Каждые 30 мин реакционную систему проверяют с помощью аппарата Хитачи для скоростной жидкостной хроматографии. Система растворителей ацетонитрил: 0,1-ная уксусная. кислота (объемное отношение 1:9) . Эту проверку осуществляют для определения окончаия реакции, так как время задержки сходного соединения 7-(5-амино- -карбоксивалерамидо )-7-метокси- в (1-метилН-тетразол-ил) -тиометил-цефем-карбоновой кислоты 1 мин 53 с, а время задержки конвертированной при этом эа счет оки ления 3-аминокислоты 7-(4-карбоксибутирамидо)-7-метокси-(1-метил- -1 Н-тетразол-ил)-тиометил-цеФем-карбоновой кислоты 4 мин 54 с По окончании реакции мицелии уда.ляют центрифугированием, а всплывающий слой отделяют путем доведения рН до 1,5-2,0 с помощью разбавленного водного раствора соляной кислоты и четырехкратного экстрагирования р ными объемами этилацетата. Экстракт в этилацетате отделяют и снова экстрагнруют буферным раствором фосфата, имеющим рН 6,0. После этого буферный раствор доводят до рН 1,5-2,0 с помощью разбавленной соляной кислоты и снова экстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата. Этилацетат ные вытяжки соединяют, сушат безводным сульфатом натрия и выпаривают досуха, после чего продукт хроматографируют на колонке с микрокристаллической целлюлозой Ачсе 1 (торговая марка) и смесью растворителей н-бутанол: уксусная кислота: вода (объемное отношение 4:1:2 ) при промывании колонки той же смесью раствори ,телей.Каждую фракцию проверяют на антимикробную активность по отношению к Ргойеа в 1 гаЬ 111 ь, отбирая фракции, обладающие этой антимикробной активностью, хроматографируют на тонкослойной пластине Ач 1 се 1 5 Г (торговая марка) и разделяют с помощью смеси растворителей изопропанол: н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 21:3: :7:9.) и смеси н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2). После этого фракции, характеризуемые ультрафиолетовым поглощением в области света 2536 Й аппарата Манасулу (фирмы Манасулу Кагаку Когио К.К.) и К 0,81 и В 0,64 соответственно, собирают, концентрируют и лиофилизуют, получая 35 мг чистой 7- (4-карбоксибутирамидо)-7- -метокси-(1-метилН-тетразол1579966816-ил) -тиометил-цефем-карбоновой кислоты.П р и и е р 6. В 10 мл 0,1 М пирофосфатного раствора с рН 8,1, содержащего 0,026 аэида натрия, растворяют 50 мг 7-(5-амино-карбоксивалерамидо) -7-метокси-(5-метил,3,4-тиадиаэол-ил)-тиометил- -3-цефем-карбоновой кислоты, прибавляют к раствору 0,5 мл суспензии активированного мицелия Тг 9 опора чагаЬ 11ГО 0755, полученного так же, как и в примере 1,а. Смесь перемешивают при нагревании на водяной бане при 33 С и аэрировании, с целью окисления Э-аминокислоты. Окончание реакции определяют тем же методом скоростной жидкостной хроматографии, как и в примере 1 б. Время задержки исходного соединения 7-(5-амино-карбоксива-. лерамидо)-7-метокси-(5-метил,3,4- -тиадиазол-ил) тиометил-цефем- -карбоновой кислоты 2 мин 55 с, а время задержки полученной окислением В-аминокислотой 7-(4-карбоксибутирамидо 1-7-метокси-З-(5-метил,3,4- -тиадиазол-ил)тиометил-цефем- -карбоновой кислоты 11 мин 19 с.По окончании реакции мицелий удаляют при 4 аС, а всплывающий слой отделяют, доводят до рН 1,5-2,0 с помощью разбавленного раствора соляной кислоты и зкстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата. Экстракты в этилацетате соединяют и экстрагируют буферным раствором фосфата, имеющим рН 6,0. Этот экстракт доводят до рН 2,5-20 и снова экстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата, экстракты соединяют, сушат безводным сульфатом натрия и выпаривают досуха в вакууме. Используя колонку с микрокристаллической целлюлозой Ач 1 се 1 (торговая марка) и смесь растворителей н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2), оста к продукта разделяют, применяя смесь растворителей того же состава. Затем отбирают фракции, обладающие активностью по отношению к Рго 1 еца е гаЬ 11 а, хроматографируют их на тонкослойной пластине Ачсе 1 5 Г и проявляют соответственно смесью растворителей изопропанол : н-бутанолуксусная кислота : вода (объемное отношение 21:3:7:9) и смесью н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2). Фракции, характеризуемые поглощением в ультрафиолете 2536 1 и 1 0,82 и К 0,77 соответственно, собирают, концентрируют, лиофилизуют и получают 32 мг чистой 7- (4-карбоксибутирамидо)-7-метокси- -3-(5-метил,3,4-тиадиазол-ил) тио метил-цефем-карбоновой кислоты,П р и м е р 7. В 10 мл 0,1 М пирофосфатного буферного раствора с рН 8,1, содержащего 0,026 азида нат 15 20 рия, растворяют 50 мг 7-(5-амино- -карбоксивалерамидо)-3-(5-карбоксиметилтио,3,4-тиадиазол-ил)тиометил-метокси-цефем-карбоновойкислоты и, после прибавления к раствору 0,5 мл суспензии активированногомицелия, приготовленного таким же образом, как и в примере 1 а, смесь перемешивают при аэрировании и нагревании на водяной бане при 33 аС, чтобы осуществить окисление. Окончание реакции проверяют каждые 30 мин с помощью скоростной жидкостной хроматографин на аппарате Хитачи так же, как и в примере 1 б. При этом время задержки исходного соединения 7-(5-амино-карбоксивалерамидо )-3-( 5-карбоксиметилтио,3,4-тиадиазол-ил) - тиометил-метокси-цефем-карбоновой кислоты 3 мин 14 с, а полученной в результате окислительного действия Фермента -2-аминокислоты 7 4- -карбоксибутирамидо) -3-(5-карбоксиметилтио,3,4-тиадиазол-ил)-тиометил-метокси-цефем-карбоновой кислоты 13 мин 24 с.По окончании реакции мицелий удаляют центрифугированием при 4 ОС, а всплывающий слой отделяют, доводят до рН 1,5-2,0 разбавленной соляной кислотой и экстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата, Экст 3 ф ракты в этилацетате собирают и сноваэкстрагируют буферным раствором фосФата с рН 6,0, экстракт доводят раз бавленным раствором соляной кислотыв воде до рН 1,5-2,0 и повторно зкс трагируют четырежды равными объемамиэтилацетата, экстракты соединяют, сушат безводным сульфатом натрия и выпаривают досуха в вакууме.Остаток разделяют, используя смесь4 растворителей н-бутанол : уксуснаякислота : вода (объемное отношение 4:1:2 , на колонке с микрокристалличеСкой целлюлозой Ачсе и тем же составом растворителей, Проверяют антимикробное действие каждой фракции по отношению к Ргоець щгаЫ 11 а, иактивные фракции хроматографируют натонкослойной пластине Ачсе 1 5 Г, проявляя разделение смесями растворителей изопропанол ; н-бутанол : уксусно ная кислота : вода (объемное отношение 21:3:7:9 и н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2 . Затем фракции, характеризуемые поглощением света в И ультрафиолетовой области 2536 Л наприборе Манасулу и Й 0,79 и 0,72 соответственно, собирают, концентрируютлиофилизуют и получают 30 мг чистой 7-(4-карбоксибутирамидо)-3-(5-карбоксиметилтио,3,4-тиадиазол-ил-)- тиометил-метокси-цефем-карбоновой кислоты,П р и м е р 8, а). Культуральнуюсреду содержащую, %; крахмала 1,0; Я глюкозы 1,0, муки соевых бобов 1,5;экстракта дрожжей 0,5, кислого фосфата калия 0,1; сульфата магния 0,05 и хлористого натрия 0,3, помещают в 500 мл колбы Сикагичи, по 100 мло в каждую, и стерилизуют при 120 С в течение 20 мин. В каждую порцию производят посев штамма У5 герСоаусеь Огяапопепь 1 ь, а затем культивируют при 30 оС в течение 48 ч.Другую культуральную среду помещают в двухлитровые колбы Сикагичи, по 400 мл в каждую, стерилизуют при 120 С в течение 20 мин и производят посев 2-3-ной бульонной культуры. Затем производят культивирование при 30 С в течение 24 ч и получают культуру для посева. 5Отдельно в два 100-литровых ферментатора вместе с 10 мл АЬесапо 1 (торговая марка), помещают по 60 л культуральной среды, содержащей,: крахмала 7; тонко размолотой клей ковины 2,0; муки соевых бобов 2,0; глицерина 0,8; кислоты Казамино 0,1; сульфата железа(111) 0,01 и 55 г гидроокиси натрия, 30 мин стерилизуют при 120 С и производят посев 800 мл, д полученной ранее культуры для посева. Затем культивируют при 30 С в течение 24 ч. К полученному культуральному бульону прибавляют раствор 5-меркапто-метилН-тетраэол,приготовлен-у ный на водном растворе гидроокиси натрия и стерилизованный при высоком давлении так, что концентрация тетра- зола 0,05. Культивирование ведут в течение 90 ч.35По окончании культивирования бульон доводят до рН 2,0 и к нему при перемешивании прибавляют аЬ 1 о 11 се (торговая марка). Полученную смесь фильтруют на фильтр-прессе; фильтраты соединяют и получают 100 л смеси 40 фильтратов,содержащих 100 мкг/мл 7-(5-амино-карбоксивалерамидо)-7- -метокси-(1-метилН-тетразол- -ил)-тиометил-цефем-карбоновой кислоты, 4б фильтрат доводят до рН 3,0, пропускают через колонку с 12 л Амберлита ХАЭ(торговая марка), колонку промывают 30 л воды и элюируют 30 л 50-ного раствора ацетона в во- р де. Элюат концентрируют до объема 5,5 л, доводят его рН до 7,5 с помощью водного раствора гидроокисн натрия, удаляют нерастворимый осадок и прибавляют к раствору 320 мл суспензии активированного мицелия штамма Тг 19 опорьь чаг 1 аЬ 111 ь 1 ОГ 0755. Смесь 4 ч перемешивают при аэрировании, доводят до рН 1,5-2,0 с помощью водного раствора соляной кислоты и экстрагируют 4 раза равными объемами 0 этилацетата; экстракты соединяют, полученные 20 л экстракта в этилацетате снова экстрагируют 2 л буферного раствора фосфата, имеющего рН 6,0. Этот экстракт в фосфатном раство- Я ре доводят водным раствором солянойкислоты до рН 1,5-2,0 и снова экстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата. Этилацетатные вытяжки соединяют и полученные в результате 8 л экстракта упаривают в вакуумедосуха, получая 15 г неочищенногопродукта, который подвергают хроматографированию на колонке с порошкомцеллюлозы так же, как это производится в примере 5 б и получают 6,1 г7-(4-карбоксибутирамидо) -7-метокси- (1-метилН-тетразол-ил)тиометил-цефем-карбоновой кислоты.П р и м е р 9. На культуральнойсреде, содержащей,г; глюкозы 5,0;пептона 1,0; кислого Фосфата калия1,0; сульфата магния 0,5; экстрактасолода 10,0; 01.-метионина 1,0 и1000 мл воды при рН 6,0 производятпосев штамма Тг 1 допорь 1 з чаг 1 аЬ)1 ь1 ГО 0755, затем культивируют по методике примера 5 а и получают 1000 илбульонной культуры, которую центриоФугируют при 2000 об/мин и 4 С, иполучают мицелий. Мицелий суспендируют в 200 мл 0,1 М пирофосфатного буФера с рН 8,1Полученную суспензию, помещают, по 50 мл в каждую,500 мл колбу Эрленмейера, прибавляют по 5 млтолуола и в течение 1 ч проводяткультивирование при 37 фС. После этого актнвированный мицелий отделяютна центрифуге при 2000 об/мин в течение 30 мин, промывают с помощьюцентрифуги 200 мл 0,1 М пирофосфатного буферного раствора с рН 8,1.Активированный мицелий снова суспендируют в 200 мл 0,1 М пирофосфатногобуфера с рН 8,1, а суспензию нагревают при перемешивании на водянойбане при 50 фС, чтобы инактивироватькаталазную активность. 5 мл полученной суспензии актнвированного мицелия прибавляют к раствору 100 мг7- (5-амино-карбоксивалерамидо)- -7-метокси-(1-метилН-тетразол- -5-ил)тиометил-цефем-карбоновойкислоты в 20 мл 0,1 М пирофосфатного буферного раствора с рН 8,1;5 чперемешивают при 33 С при аэрировании, обрабатывают смесь, как указано в примере 5 б, и получают 7-(4- -карбоксибутирамидо)-7-метокси-(1- -метилН-тетразол-ил)тиометил- -цефем-карбоновую кислоту.П р и м е р 10. Мицелий, полученный из Тг 19 опорв 1 ь чаг 1 аЬ 11 э по методике примера 5 а, замораживают приотемпературе ниже -20 С больше 1 ч, а затем оставляют при комнатной тем.пературе до размерзания и суспендируют в 200 мл 0,1 М пирофосфатного раствора с рН 8,1; 5 мл этой суспензии прибавляют к раствору 100 мг 7- (5-амино-карбоксивалерамидо)-7- -метокси- (1-метилН-тетразол- -ил)тиометил-цефем-карбоновой кислоты в 20 мл.0,1 М пирофосфатного