Маркер оценки аттенуации вирусов полиомиелита

(55 А ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ довател ьский клинической Т,П,Грушко88, с. 256.АЦИИ ВИРУ 6 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(54) МАРКЕР ОЦЕНКИ АТТЕНУСОВ ПОЛИОМИЕЛИТА Изобретение относится к вирусологии, а именно к средству оценки степени аттенуации вирусов. Известно использование прополиса и прополисных препаратов в медицине в терапевтических целях,Цель изобретения - расширение ассортимента маркеров, используемых для оценки степени аттенуации вирусов за счет выявления новых дополнительных свойств прополиса, ранее неизвестных.Для достижения цели в качестве маркера используют экстракт прополиса,В основу маркера положен тот факт, что динамика подавления репродукции вакционных вариантов вируса полиомелита в культуре клеток, при наличии в поддерживающей среде экстракта прополиса, значительно опережает аналогичный процесс, касающийся для вариантов вируса полиомиелита. Если разница показателей интенсивности подавления репродукции изолятов вируса полиомиелита в культуре клеток при наличии и отсутствии прополиса (0,800) в поддерживающей среде составляет2,0 Я ЦПДБо/мл, то их относят к диким. При3,0 9 ЦПДБ 0(л - к вакцинным, а если разница этих показателей находится в пределах 2,0 - 3,09 ЦПДБо/л, то их относят к(57) Изобретение относится к области вирусологии, Цель - использование экстракта прополиса в качестве маркера, Сущность изобретения: динамика подавления репродукции вакцинных вариантов вируса полиомиелита в культуре клеток при наличии в среде экстракта прополиса опережает аналогичный процесс, касающийся диких вариантов. Положительный эффект; расширение ассортимента маркеров. п ром ежуточн ы м. Технология оп редел ен ия предлагаемого нами маркера несложна по выполнению, не связана со значительными материальными затратами, так как исключает использование дорогостоящих материалов,и реактивов.Использование предлагаемого маркера для оценки степени аттенуации вирусов показало, что информация. полученная с помощью этого признака. полностью коррелирует с антигенным признаком. Во всех опытах было отмечено полное совпадение антигенного (известного) маркера с новым маркером, предлаГаемым нами.П р и м е р. Была дана оценка степени аттенуации 60 изолятов вируса полиомиелита, выделенных от больных полиомиелитом, из образцов проб водных объектов (сточные воды, вода открытых водоемов), а также стандартных штаммов вируса полиомиелита, диких и вакционных по ряду известных. а также по предлагаемому нами маркеру,Изготовление экстракта прополиса (маркера).Используют 8,000-ный водный экстракт прополиса, собранный на пасеках пчеловодами колхоза "Победа" Рыбинского района ССР Молдова, который получают по следу 1799598ющей методике: отвешивают 20,0 г прополиса, растирают в ступке, затем эту измельченную массу высыпают в стеклянную колбу, куда добавляют до 100,0 мл дистиллированной воды. Экстракцию проводят при 42,0+0,1 С втечение 4 суток, периодически встряхивая ( в течение 10 мин) содержание колбы 5 - 6 раэ в день. Полученный раствор стерилизуют через асбестовый фильтр и сохраняют в объеме 20 - 25 мл в темных флакончиках, хорошо,.закупоренных при температуре +40 С. После стабилизации устанавливается желто-светлый (лимонный) цвет. При использовании водный экстракт прополиса разбавляют таким образом, чтобы конечная концентрация в поддерживающей среде клеток составила 0,8+0,1 ,Приготовление перевиваемой культуры НЕросуществляют следующим образом.Перед посевом культуры обязательно проводят просмотр и оценку монослоя. Отбирают культуру со сплошным монослоем клеток имеющих типичную для данной линии морфологию, с четко выраженными границами между клетками, Клетки снимают со стекла матрасов трипсин-версеном, Для этого приготавливают смесь равных объемов 0,25-ного раствора трипсина и раствора версена, подогревают ее в водяной бане до 30-35 С. В начале с матраса выливают питательную среду, клеточный слой промывают 3 раза фосфатно-буферным раствором (рН 7,5), не содержащим ионы кальция и магния. Затем тепловой смесью (трипсинверсен) заливают монослой культуры клеток так, чтобы все участки были покрыты жидкостью, В матрасы, объемом 100, 250 и 1000 мл, раствор добавляют, соответственно, по 10, 15 и 30 мл. Матрасы встряхивают и помещают в термостат(37 С) на 15 - 20 мин до полного отделения клеток от поверхности стекла, Крупные конгломераты клеток диспергируют, пипетируя несколько раз клеточную взвесь, Суспензию клеток центрифугируют 10 мин при 2000 об./мин, смесь трипсин-версен удаляют, Осажденные центрифугированием клетки ресуспендируют в небольшом объеме ростовой питательной среды, количество клеток подсчитывают в счетной камере Горяева Взвесь клеток контролируют на бактериальную стерильность, разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в 1,0 мл содержалось 60 тыс. клеток. В качестве среды для выращивания клеток используют среду Игла, среду 199, Игла-МЕМ с добавлением телячьей сыворотки крупного рогатого скота - 10 и антибиотиков. Перевиваемую5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 культуру НЕ рразливают в пробирки по 1,0 мл, В качестве поддерживающей среды используют те же вышеприведенные питательные среды без добавления сыворотки, Обновление сплошного монослоя клеток новой генерации наблюдают через 5 - 6 суток.Титрование изолятов вируса полиомиелита того или иного иммунологического типа с целью изучения степени их аттенуации, а также стандартных вакцинных и диких штаммов вируса полиомиелита проводят в культуре клеток НЕр, методом конечного разведения по цитопатогенному действию и выражают в 19 (ЦПДбо/). Для титрования штаммов вируса полиомиелита в начале готовят его разведение, обычно десятикратные от 10 до 10, Во все пробирки вносят по 9,0 мл стерильного физиологического раствора или раствора Хэнкса. Затем в первую пробирку вносят 1,0 мл вирусосодержащего материала и получают разведение 10 (1:10). При помощи новой пипетки содержимое первой пробирки тщательно перемешивают и 1,0 мл переносят во вторую пробирку, получая разведение 10 (1:100) и т.д. до 10Затем водный экстракт прополиса (8,0) в объеме 0,5 мл соединяют с равным объемом вирусосодержащего материала каждого разведения. Смесь экстракта прополиса и вируса выдерживают в течение 1 ч при 37 С. Предварительно перед заражением монослоя культуры Н Е рсмесью (вирус + экстракт прополиса) производят 3 раза отмывание культуры клеток от сыворотки раствором Хэнкса, рН 7,4 или раствором Эрла - рН 7,6. На каждое десятикратное разведение вирусосодержащего материала используют по 4 пробирки с культурой клеток, Смесь экстракта прополиса и вируса в объеме 0,2 мл добавляют в пробирки с культурой клеток, в которые предварительно заливают поддерживаемую среду в объеме 0,8 мл. Пробирки помещают в термостат в специальных лотках в горизонтальном положении, Состояние зараженных культур периодически проверяют под световым микроскопом в течение 7-ми дней, Результат цитопатического действия ЦПДБо вируса считается положительным, если не менее половины клеток в культуре подвергались специфической дегенерации.Опыт сопровождается следующим контролем:а). Контроль репродукции стандартных штаммов вируса полиомиелита; титруют вирус полиомиелита. в культуре клеток НЕрпри отсутствии и наличии экстракта прополиса в поддерживающей среде клеток в концентрации (0,8 ):1799598 Результаты оценки динамики подавления интенсивности репродукции штаммов вируса полиомиелита в культуре клеток НЕрпри наличии и отсутствии водного экстракта п рополиса в поддерживающей среде учитывают только при соблюдении следующих контролей: 25 30 35 40 45 Составитель Д.ПоповТехред М,Моргентал Корректор Н.Милюкова Редактор С.Кулакова Заказ 1123 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 б). Контроль культуры клеток; используют интактную культуру клеток НЕрпри отсутствии и наличии в поддерживающей среде (0,8%) экстракта прополиса. Титр (50,0 оэффективной дозы) вычисляют по методу Рида-Менга и методом пробитов, используя специальные таблицы (Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды, 1982, М 75, стр, под ред, проф. Дроздова С,Г, и д.м.н. Казанцевой В,А,),1. Монослой незараженной культурыНЕр(при наличии и отсутствии в поддерживающей среде экстракта прополиса в конечной концентрации 0,8%) должен 5 сохраниться до конца опыта, т,е. до седьмыхсуток включительно после заражения (контроль культуры клеток),2. Разница в интенсивности репродукции в культуре клеток НЕрпри отсутствии 10 и наличии экстракта прополиса в поддерживающей среде для аттенуированных стандартных штаммов вируса полиомиелита составляет более 10ЦПДьо/мл, тогда какз,одля диких стандартных штаммов вируса 15 полиомиелита этот показатель составляет10ЦПДбо(млФормула изобретения П риме нение 0,8 о -ного раствора п ропо лиса в качестве маркера оценки аттенуации вирусов полиомиелита.