Способ определения проницаемости мембраны нервной клетки

(57) Использтальная био Я ПРОНИЦАЕОЙ КЛЕТКИа, эксперименффективности ОПРЕДЕЛЕН БРАНЫ НЕРВ вание; медицин логия, оценка иологии, а ой оценкиимых кле- кциональышение точн ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР)(56) Епифанова О.ИТерских В.ВЗахаА.Ф. Радиоавтография, МВысшая шк1977, с.42. Изобретение относится к бименно к методам количественнпоказателей метаболизма возбудточных элементов в период их фунной активности.Цель изобретения - пов ости способа,Способ осуществляется следующим образом, Находящиеся в составе препаратаили в изолированном состоянии функционально активные нервные клетки помещаютв проточную камеру, обеспечивающую непрерывную смену физиологического раствора. С помощью микроманипулятора кисследуемому нейрону под визуальным контролем подводят регистрирующий микроэлектрод, сигнал с которого подают на входусилителя биопотенциалов, Погружениемикроэлектрода заканчивают после появления на выходе усилителя характерных высокоамплитудных импульсов, соответствующихразрядам клетки,С помощью другого микроманипулятора к этому же нейрону подводят закрепленный на пьезокерамическом элементе биологически активных веществ, исследование клеточных мембран. Цель изобретения - повышение точности способа, Сущность изобретения; радиоактивный аналог исследуемого вещества подводят к тестируемой клетке попеременно с намеченным изотопами исследуемым веществом так, что радиоизотопы присутствуют в окружающей клетку среде только в периоды времени, соотвествующие строго определенной фазе генерации потенциалов действия,микрокатетер, из которого под давлением подается радиоактивно меченное вещество, Подключенный к выходу усилителя биопотенциалов (через преобразователь уровня сигнала) пьезоэлемент устанавливают таким образом, цтобы выходящая из катетера микроструя была направлена на плазматическую мембрану регистрируемой нервной клетки только в период генерации потенциала действия, т.е, только во время механической деформации пьезоэлемента, вызываемой соответствующим электрическим импульсом, В межимпульсные интервалы времени траектория микроструи проходит минуя область локализации тестируемого нейрона, и происходит отмывка изотопов общим протоком физиологического раствора. Цикл подведения и отмывания изотопа проводят многократно. Затем клеточную ткань фиксируют и авторадиографически определяют количество поглощенного исследуемой клеткой радиоактивно меченного вещества.П р и м е р, Проводилось определение проницаемости для одной из аминокислот (лейцина) плазматической мембраны фоноСоставитель Л, БобравниковТехред М.Моргентал Корректор З.Салко Редактор Заказ 375 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 воактивных нейронов париетального ганглия (П,Па 1) виноградной улитки в период генерации потенциалов действия. Полуинтактный препарат моллюска помещали в ванночку для злектрофизиологических исследований. Скорость протока раствора Рингера составляла 5 мл/мин, Содержащий ЗН-лейцин раствор(1 млКюри/мл) подавали со скоростью 0,2 мл/мин из катетера диаметром 0,3 мм. Электрическую активность нейрона отводили экстраклеточным способом, В качестве"регистрирующего электрода испольэовали стеклянные микропипетки (диаметр кончика 1 мкь 4, заполненные 2,5 М раствором натрия хлорида. Подведение микроэлектрода и установленного на пьезоэлементе катетера осуществляли с помощью манипуляторов марки ММпод контролем микроскопа МБС. У каждой исследуемой клетки регистрировали 6000 потенциалов действия, что соответствовало 1,5 - 2-часовому периоду ее инкубации. Продолжительность подведения импульсной изотопной метки во время отдельного спайка составляла 10 мс. Длительность общего периода пооведения равнялась 1 мин.После завершения тестирования нервную ткань замораживали в изопентане, охлажденном жидким азотом доС, а затем на 12 ч помещали в абсолютный этиловый спирт (Т =-40 С), Срезы толщиной 10 мкм монтировали на предметных стеклах, которые после этого покрывали тонким слоем фотоэмульсии типа Р, Время экспозиции всех радиоавтографов составляло 3 недели. При проявке использовали проявитель Д, а в качестве фиксажа - 30 о -ный раствор гипосульфита. Количество поглощенного за 1 мин изотопа оценивали путем подсчета количества зерен восстановленного серебра над контуром исследуемой клетки. При статистической обработке данных использовали критерий Стьюдента, Полученные результаты сопоставляли с контрольными определениями, когда биоэлектрическая активность у нейоонов не регистрировалась, а подведение ЗН-лейцина той же концентрации и удельной радиоактивности осуществлялось непрерывно на протяжении 1 мин инкубации каждой клетки. Были полученыследующие результаты.Данные по основной серии (подведениеимпульсной метки)5 Количество исследованных клеток 20Количество зерен восстановленного серебра 14,7 + 0,42Дисперсия 1,87 "0 Коэффициент вариациисреднего значения 12,7% Данные по контрольной серии (по прототипу)15 Количество исследованных клеток 20Количество зерен восстановленного серебра 6,45 - 2,0Дисперсия 8,73 20 Коэффициент вариациисреднего значения 135,35 Различия величин дисперсии и коэффициентов вариации статистически достоверны (р0,001).Таким образом, как показывают полученные результаты, предлагаемый способпо сравнению с прототипом позволяет повысить точность определения проницаемости плазматической мембраны нервных 30 Формула изобретения 35 Способ определения проницаемостимембраны нервной клетки, включающий инкубацию исследуемой клетки в среде, содержащей радиоактивно меченное соединение, удаление изотопа, фиксацию клетки и авторадиографическую оценку количества поглощенного клеткой соединения, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, к клетке дополнительно подводят микроэлектрод, регистрирующий разрядную активность, при наличии потенциала действия подводят изотоп, отмывают его в межимпульсном интервале, при этом цикл подведения и отмывания изотопа проводят многократно.50