Способ иммуноферментного определения антител класса g к вирусам кори и эпидемического паротита

(51) 5 О ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН АТЕНТУ довдтел ь- икробио-иссле ии и м довател ь- икробиои Решетние иммубыстрого Вопросы с- б(21) 4883887/13(71) Ленинградский научно-исслеский институт эпидемиологии илогии им. Пастера(73) Ленинградский научноский институт эпидемиологлогии им,Пастера(56) Ведунова С,Л., Мальцева Н,Нникова В.И, Сравнительное изученоферментных тест-систем длявыявления антител к вирусу кори. -вирусологии, 1986, М 6, с,752 - 755 Изобретение относится к области иммунобиотехнологии и может быть использовано в методах иммуноферментного анализа, в экспериментальной иммунохимии и биотехнологии, сероэпидемиологии, при диагностике вирусных инфекций и оценке иммуногенности вирусных вакцин,Известен способ определения антител к различным вирусам при адсорбции антигенов непосредственно в лунках полистироловых панелей,Однако при использовании этого метода авторы модифицировали планшеты как инфицированными вирусом кори клетками (вирусный антиген), так и неинфицированными клетками культуры ткани (контрольный антиген), не производя при этом никакой очистки вируса от примесных белков, При этом результаты иммуноферментной реакции (ИФР) оценивали по разнице(54) СПОСОБ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ КЛАССА О КВИРУСАМ КОРИ И ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ПАРОТИТА(57) Использование: иммунобиотехнология, диагностика вирусных инфекций и оценка иммуногенности вирусных вакцин. Сущность, вирусы кори и эпидемического паротита ультрацентрифугируют при 25 - 30 тыс. об/мин в течение 3 - 4 ч и адсорбируют в лунках полистироловой панели в течение 16 - 18 ч при 4 С. Затем панель трехкратно отмывают, вносят исследуемую пробу и коньюгат меченный пероксидазой хрена и белок А 31 арйуососсцз ацгецэ, Концентрация конъюгата составляет 100 нг действующего начала на 1 мл вносимого в лунки раствора. 2 ил. показателеи оптическои плотности виру ного и контрольного антигенов, Это неудо но, громоздко и главным образом мало эффективно при выявлении корневых антител в низкотиражных иммунных сыворотках; стандартизовать такую модификацию практически нереально. Кроме того, авторы использовали антитела против глобулинов человека, меченные пероксидазой хрена, причем конъюгацию производили сами в лабораторных условиях, что не обеспечивало стабильности получаемых результатов; нами же использован коммерческий препарат - белок А, меченный пероксидазой хрена. Вследствие этого конъюгат использовали в одной концентрации согласно утвержденной нормативно-технической документации, В заявляемом способе величина оптической плотности используемого коньюгата составляет 2,63 ед.5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Известен также способ определения противовирусных антител класса 0 в иммуноферментном анализе (ИФА), включающий очистку вируса ультрацентрифугированием с последующей модификацией им полистиролового носителя в форме шариков и постановкой ИФР на планшете в присутствии конъюгата на основе антител к иммуноглобулинам класса 6,Однако, данный способ является сложным ималочувствительнымв случае определения антител к вакцинйым штаммам вирусов. В описании прототипа нет сведений о величинах концентраций модифицирующего агента; нами же отработаны оптимальные условия данной операции: 2,5 - 5 мкг/мл для штамма "Эдмонстон" вируса кори; 20 мкг/мл для штамма "Ленинград" вируса кори; 15 - 20 мкг/мл для штаммов "Эндерс" и "Ленинград" вируса эпидемического паротита. Предлагаемый нами способ более чувствителен выявляет антитела в концентрациях в 5-10 раз меньших), чем аналогичные способы, при которых детекцию антител проводят с помощью энзим-меченных антител в качестве антиглобулиновых конъюгатов,Целью изобретения является упрощение и повышение чувствительности способа при полном сохранении специфичности.Указанная цель достигается тем, что в способе, предусматривающем очистку вирусов центрифугированием с последующей адсорбцией их на поверхность полистиролового носителя и постановку ИФР с исследуемыми пробами в присутствии конъюгата и последующим учетом результатов, имеются следующие отличия: очистку вирусов проводят ультрацентрифугированием при факторе разделения 25 - 30 тыс, об/мин в течение 3 - 4 ч; поверхность лунок полистиролового планшета модифицируют очищенными вирусами в концентрации 5 - 20 мкг/мл и при определении противовирусных антител в качестве коньюгата используют белок А золотистого стафилококка, меченный пероксидазой хрена.На фиг. 1 и 2 иллюстрируют предлагаемый способ,П р и м е р 1, Определение антител класса 0 к вирусу кори (в качестве иммуносорбента использован штамм "Ленинград"),Стадия 1. Определение концентрации иммуносорбента.Готовят последовательные разведения очищенного ультрацентрифугированием вируса кори, штамм "Л" от 2,5 до 25 мкг/мл на карбонатно-бикарбонатном буферном растворе 0,05 моль/литр с рН = 9,5 +0,1 (КБК). В качестве контрольных сывороток при постановке ИФР используют сыворотки крови человека: иммунную (с титром 1:5 в РТГА с 4 ГАЕ коревого диагностикума) и неиммунную (корневые антитела не выявлены при постановке РТГА с 1 ГАЕ коревого диагностикума) в разведении 1:100 на 0,01 М фосфатно-солевом буферном растворе с добавлением хлористого натрия, 0,15 моль/литр и 0,05 твина(ФСБ-Т). рН раствора 7,2 - 7,4, Постановку ИФР осуществляют на полистироловых плоскодонных планшета для иммунологических реакций(производства Ленинградского завода "Пластополимер"), Для этого; приготовленные разведения вируса в объеме 0,1 мл выдерживают в лунках планшета в течение 16 - 18 ч, при 4 С, либо 2 ч при 2 С, после чего его удаляют и проводят трехкратную промывку лунок раствором ФСБ-Т, Затем в лунки планшета вносят иммунную и неиммунную сыворотки в вышеуказанном разведении, выдерживают 1 ч при 37 С, далее содержимое лунок удаляют и вновь проводят трехкратную промывку лунок раствором ФСБ-Т. После этого в лунки вносят конъюгат - белок А, меченный пероксидазой хрена, приготовленный на растворе ФСБ-Т (концентрация конъюгата - 100 нг действующего начала на 1 мл раствора; объем, вносимый в лунку - 0,1 мл), Раствор конъюгата выдерживают в лунках в течение 1 ч при 37 С, затем его удаляют и проводят пятикратную промывку лунок раствором ФСБ-Т. Затем в лунки планшета вносят по 0,1 мл хромоген-субстратной смеси, приготовленной непосредственно перед использованием следующим образом: в 10 мл 0,2 моль/л фосфатно-цитратного буферного раствора с рН 5,0 (ФЦБ) растворяют 4 мг ортофенилендиамина дигидрохлорида и 0,010 мл 30 ,-ного раствора перекиси водорода. Смесь выдерживают в лунках 30 мин в темноте 18 - 22 С, затем реакцию останавливают путем добавления 1 н. раствора соляной кислоты по 0,1 мл в каждую лунку. Результаты анализа фотометрируют на вертикальном спектрофотометре любой конструкции при длине волны проходящего света 492 нм, Полученные результаты ИФР представлены на фиг, 1. При этом видно, что максимальная разница в показателях оптической плотности (ОП) между иммунной и неиммунной сыворотками соответствует уровню концентрации штамма "Л" вируса кори в 20 мкг/мл, При этом у неиммунной сыворотки показатель ОП должен быть обязательно ниже уровня 0,2, а у иммунной -выше этого значения,Стадия 2, Скреннинг-анализ исследуемых сывороток в ИФА с использованием в качестве иммуносорбента штамма "Л"вируса кори, 17907695 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Для проведения данного исследования взято 206 сывороток крови от взрослых доноров в возрасте 27 - 47 лет, Все сыворотки были исследованы предварительно в РТГА с 4 ГАЕ коревого диагностикума, и те из них, которые не содержали специфических антител, были переставлены в РТГА с 1 ГАЕ коревого диагностикума, Техника постановки ИФР с данными сыворотками аналогична описанной выше, использованной при определении концентрации иммуносорбента, При проведении анализа особое внимание обращали на результаты постановки ИФР с группами сывороток, где коревые антитела не были обнаружены в РТГА с 1 ГАЕ и с минимальными титрами (1:5), т,к, последняя группа является в эпидемиологическом отношении наиболее уязвимой в плане частичной утраты иммунитета к вирусу кори с течением времени. В то же время титр 1:5 с 1 ГАЕ принято считать защитным, Каждая из исследованных сывороток была проставлена в ИФА в двух параллельных лунках и в анализ брали среднеарифметическое значение. Суммарные результаты данного исследования представлены в табл. 1.Из представленной в табл. 1 видно, что все исследованные сыворотки, являющиеся неиммунными по данным РТГА, имели при постановке ИФА показатели ОП ниже, чем 0,2 (при максимальном значении 0,17; минимальном - 0,12 и среднем - 0,13). В то же время, все иммунные по данным РТГА исследованные сыворотки, в том числе и с минимальными титрами, имели аналогичные показатели достоверно выше 0,2,Все вышеизложенное свидетельствует о высокой чувствительности данного способа при определении коревых антител в том числе и к вакцинному штамму, т.к, среди исследованных сывороток примерно 50 составляют сыворотки от привитых и о пригодности теста для проведения скреннинганализа с целью выявления специфических антител класса 6 к вирусу кори (поскольку используемый конъюгат позволяет обнаружить практически все имеющиеся антитела класса 0 и частично М.П р и м е р 2, Определение антител класса 6 к вирусу кори (в качестве иммуносорбента использован штамм "Эдмонстон" вируса кори,Стадия 1, Определение концентрации иммуносорбента,Готовят последовательные разведения очищенного ультрацентрифугированием штамма "Эдмонстон" вируса кори 2,5 - 25 мкг/мл на растворе КБК, Контрольные сыворотки и все остальные ингредиенты, необходимые при постановке ИФР, те же, что и в примере 1. Однако концентрация конъюгата составляет в данном случае 200 нг действующего начала на 1 мл раствора, Методика постановки ИФР аналогична примененной в примере 1. Полученные при этом результаты представлены на фиг, 1. При этом видно, что максимальная разница в показателях ОП между иммунной и неиммунной сыворотками соответствует уровню концентрации штамма "Эдмонстон" вируса кори в 2,5 - 5 мкг/мл.Стадия 2. Скреннинг-анализа исследуемых сывороток в ИФА с использованием в качестве иммуносорбента штамма "Эдмон- стон" вируса кори.Для проведения данного исследования взяты те же 206 сывороток от взрослых доноров, что и в примере 1, Суммарные результаты данного исследования представлены в табл, 2. Из табл, 2 видно, что все неиммунные (по дачным РТГА) сыворотки имели в ИФА показатели экстинкции ниже 0,2; в то же время все иммунные сыворотки, етом числе и низкотитражные, имели показатели ОП выше 0,2.Анализ сопоставления данных табл, 1 и 2 свидетельствует о высокой чувствительности способа при определении коревых антител класса О к вакционному и "дикому" штаммдм вируса кори.П р и м е р 3. Определение антител класса Е к вирусу эпидемического паротита (в качестве иммуносорбента использованы штаммы "Ленинград" и "Эндерс"),Стадия 1, Определение концентрации иммуносорбента,Исходным сырьем для получения иммуносорбентов служили: а) вируссодержащая аллантоисная жидкость - штамм "Эндерс" и б) культуральная вируссодержащая жидкбсть - штамм "Л", Оптимальным режимом очистки для приготовления качественного иммуносорбента явилось ультрацентрифугирование в режиме 25 - 30 тыс, об/мин в течение 3 - 4 ч.Готовят последовательные разведения обоих иммуносорбентов в концентрации от 5 до 25 мкг/мл на растворе КБК. Контрольными сыворотками служили; а) неиммунная (не имеющая антител к вирусу эмидемического паротита (ВЭП) по данным реакции нейтрализации (РН) и торможения гемагглютинации (РТГА); б) иммунная низкотитражная (титр специфических антител поданным РН составляет 1;4, а по даннымРТГА 1:10). В анализ намеренно взята такая низкотиражная сыворотка, т,к, ее титр соответствует минимальному защитному,гарантирующему невосприимчивость микроорганизма к ВЭП, Все вспомогательные ингредиенты, необходимые для постановкиИФР аналогичны использованным в приме1790769 Формула изобретения Таблица 1 Выявление коревых антител класса 0 методом ИФА с использованием в качестве иммуносорбента штамма "Л - 16" вируса кориПоказатели оптической плотности 1=492 нм Количество исследованных сыТитр вРТГА среднеарифметическийминимальный максимальный 0,130,02 047+ 0 05 0,85+ 0,04 0,93- 0,05 0,97- 0,05 1,28- 0 12 0,120,02 0,31 0,05 0,68- 0,07 0,71+ 0,04 0,65- 0,04 1,12- 0,1 0,17 0,01 0,69+ 0,04 0,93+ 0,051,12+ 0,1 1,19+ 0,9 1,34 0,14 1;5 с 1 ГАЕ1:5 с 1 ГАЕ1;5 с 4 ГАЕ1:10 с 4 ГАЕ1;20 с 4 ГАЕ1;40 с 4 ГАЕи выше ре 1. Концентрация конъюгата составила 100 нг действующего начала на 1 мл раствора, Методика постановки ИФР аналогична приведенной в примере 1, Полученные при этом результаты представлены на фиг, 2, На представленной фиг. 2 видно, что максимальная разница в показателях ОП между неиммунной и иммунной низкотитражной сыворотками соответствует уровню концентрации обоих примененных иммуносорбентов в 15 - 20 мкг/мл, При этом отчетливо видно, что для постановки ИФА пригодны оба иммуносорбента, в то же время использование для адсорбции на твердую фазу очищенного ВЭП на основе штамма "Л" предпочтительнее, т.к. показатели ОП иммунной сыворотки приближаются к 0,5(при использовании ВЭП штамма "Эндерс" - на уровне 0,3) при экстинкции неиммунной сыворотки на уровне, ниже чем 0,2.Стадия 2. Скреннинг-анализ исследуемых сывороток в ИФА с использованием в качестве иммуносорбента штаммов "Л" и "Эндерс" вируса эпидемического паротита,Для проведения данного исследования взяты 109 сывороток от взрослых доноров в возрасте от 27 до 42 лет. Все сыворотки были исследованы предварительно в РТГА с паротитн ым диагностикумом (с 2 ГАЕ), Техника постановки ИФР в данном случае аналогична использованной при определении концентрации иммуносорбента, При этом особое внимание обращали на результаты постановки ИФР с сыворотками, неиммунными по данным РН и РТГА (21 сыворотку, неиммунную по данным РТГА дополнительно исследовали в рН с 31 ГАдЕ 50/0,5 мл ВЭП, и специфических антител при этом также не обнаружили). Каждая из исследованных сывороток проставлена в ИФА в двух параллельных лунках и в анализ брали среднеарифметический показатель, Суммарные результаты данного исследования отражены в табл, 3,Из табл, 3 видно, что все неиммунные поданным РН и РТГА сыворотки имели в ИФА показатели ОП ниже 0,2; в то же время все иммунные сыворотки имели аналогичные 5 показатели выше 0,2,Таким образом, выполненные примерыдемонстрируют достижение целей изобретения, Использование данного способа позволяет по сравнению с прототипом;10 1. Упростить анализ за счет исключенияиз ИФР модифицированных полистироловых шариков, Это изъятие имеет следствием сокращение комплекта тест-системы и ее удешевление.15 2. Повысить чувствительность способа.Этот вид положительного эффекта проиллюстрирован приведенными примерами, из которых видно, что чувствительность данного способа находится на уровне наног раммовых концентраций антител в 1 млисследуемых сывороток при полном сохранении специфичности, как при выявлении антител к "диким", так и вакционным штаммам на модели вирусов кори и эпидемиче ского паротита. Способ иммуноферментного опреде ления антител класса 6 к вирусам кори иэпидемического паротита, предусматривающий очистку вирусов центрифугированием, адсорбцию их на полистироловом носителе, добавление исследуемой пробы и 35 антиглобулинового реагента с последующим учетом результатов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, очистку вирусов проводят при 25 - 30 тыс. об/мин в течение 3 - 4 ч, 40 на полистироловом носителе их адсорбируют в концентрации 5 - 20 мкг/мл, а в качестве антиглобулинового реагента используют конъюгированный с пероксидазой хрена белок А Ятарпу ососсуз ацгецз.4510 1790769 Таблица 2 Выявление коревых антител класса 6 методом ИФА с использованием в качестве иммуносорбента штамма "ЭДМОНСТОН" вируса кориа блица 3 ротитных антител класса 0 методом ИФА с в качестве иммуносорбента штаммов "Л - 3"рс" вируса эпидемического паротита Выявление спользован и "ЭКолич исслед Показатели ОП Титр вРТГА с2 ГАЕ пароитного диагности кума твоан-роШтэммы для риготовлеия иммуно- сорбента н минимэльныи максимальныйсреднеари метически ных ь 33"Г Составитель В.ЗотинТехред М,Моргентал КоРРектоР З.Салко Редактор Т.Иванова Заказ 3(5 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 Показате"и оптическойЮу,Ъ,11ггавл 1 гн яд оа т 3лиг и о ъд тг.Г л тс сс ":ГАК