Способ определения концентрации сульфидов в физических средах

СОЮЭ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 33 18 ТЕНИ Изобрет анализу им анализе, хи для контрол почвы и атм Целью ние точиос сульфидов.к ферментномуся в химическоеском анализприродных во ение относит ожет применя мико-тех ноло я загрязнени осферы.изобретения и определен ляется повышея концентраци ГОСУДАРСТВЕНЮЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(56) 1, Химический анализ воздуха промыш- .ленных предприятий, Химия, Ленинград,1973, с. 398,2. Гершкович Е.Э., Методы определениявредных веществ в воздухе. Под ред. проф.Перегуд Е.А., Л., 1968, с. 95.3. Лакшминвраянайах Н, Мембранныеэлектроды, ЛХимия, 1979, с. 317.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ СУЛЬФИДОВ В ФИЗИЧЕСКИХ , СРЕДАХ(57) Изобретение оносится к ферментному анализу и может применяться в химическом анализе. химико-технологическом анализе, для контроля загрязнения природных вод, почвы и атмосферы. Целью изобретения является повышение точности определения. В экспериментальную ячейку вносят биокатализатор с моноамииооксидаэной активностью, растворенный в буфере с рН 7 - 9, добавляют тирамин или серотонин, выдер.живают получейную смесь, определяют активность фермента, вносят анализируемую пробу в смесь и повторно определяют активность фермента. После этого рассчитывают соотношение полученных величин активностей фермента и определяют концентрацию сульфидов в пробе по калибровочному графику. Поставленная цель достигается тем, что в качестве фермеитного препарата используют биокаталиэатор с моноаминоксидазной активностью, рН буферного раствора составляет от 7 до 9, в в качестве субстрата использую тирамии или серотонин,Повышение точности определения предложенным способом оказалось воэможным с применением биокатализатора с МАО активностью. Ингибирующее действие сульфидов на МАО оказалось сильнее, чем на другие ферменты, в том числе на пероксидазу. Уже при концентрации Н 28 и сульфидов 1 10 М их ингибирующее действие вызывает заметное изменение ферментативной активности МАО. Применение фермента в иммобилизованной форме позволяет определить Ферментативную активностьпрепарата при повышенной температуре, обеспечивающей проявления наименьших изменений ферментативной активности,Среда буфера с рН 7,0 - 9,0 оказаласьоптимальной для взаимодействия сульфидов с МАО. Данная область рН также обеспечивает смещение равновесия в процессе диссоциации Н 25 в сторону образования ,. иона сульфида. Последний является ингибиуоррм фермента МАО, Степень ингибированЮ МАО зависит от концентрации иона сульфида, следовательно, и от.концентрации сероводорода. О степени инги.- бирования МАО судят по изменейиюферментативной активности в реакции окислительйого деэаминирования моно- аминов, например тирамина, серотойина.Применение двух субстратов позволяетопределить сульфиды при любой концентрации их в исследуемой среде, Это особенно важно для контроля высоких содержаний анализируемого вещества, например, в промышленных сточных водах, илах и т.д. МАО активность препарата можно измерять любым методом определения активности этого фермента(по Конвею, электродом с газовым зазором и др.).Использование предложенного способа не требует предварительной обработки мутных или окрашенных сточных вод. Коллоидный состав анализируемой пробы не влияет на точность результата анализа. Отсутствие предварительной обработки анализируемой пробы исключает ошибку из-за возможного связывания присутствующего сул ьфида.В случае измерения активности МАО спомощью электрода с газовым зазором ошибка составляет + 1, В предлагаемом способе объем анализа не влияет на точность результата, В случае высоких концентраций Н 23 анализируют меньший объем исследуемой пробы. Это особенно важно при анализе воздуха в зонах очистных сооружений, при метановом брожении активного ила и в биогазах при анаэробном сбраживании сельскохозяйственных отходоа, где концентрация сероводорода может достигать 1. Способ заключается в следующем.Определяется МАО активность иммобилизованного препарата по субстрату тирамину или серотонину. Ферментный препарат инкубируется с пробой, содержащей Н 23 или растворенный сульфид при заданном рН 7,0-9,0 в буфере. Послеинкубации определяется остаточная активность иммобилизованной МАО тем же спо собом определения активности. Находятсоотношейие ферментативных активностей до/Й и далее 9 Й/Й. По калибровочномуграфику соответствующего субстрата приданной температуре инкубации находятконцентрацию сульфида в анализируемойпробе.Пример 1,Определение исходной МАО активности.0,4 г биокатализатора с МАО активностью согласно авт. свид. М 1146322 помещают в ячейку, которую на 10 мин помещают в0;01 М фосфатный буфер с рН 7,0. Затемячейку с Ферментным препаратом перено 25 сят в.термостатируемый сосуд электрода сгазовым зазором, Туда же заливают реакционную смесь: 0,1 М Фосфатного буфера 3 мл(рН 7,0) и 1 мл субстрата - серотонина сконцентрацией 4 10 М (концентрация впробе 1 10 М). В течение 10 мин черезраствор пропускают кислород при постоянном перемешивании. Далее поток перекрывают и герметически закрытый сосуд .выдерживают 50 мин при 20"С с интенсив 35 ным перемешиванием, После инкубации. Ферментсодержащую ячейку вынимают, всосуд добавляют.1,4 г Н С 1. закрывают пробкой с рН стеклянным электродом, на поверхйость которого помещена капля 0,2 -ного40 раствора тритона Хв бидистиллированной воде, снова пропускают 02 без СО 2и затем черезкапилляр вводят в реакционную смесь 0,2 мл 1 М МаОН (рН 12) дляполного освобождения аммиака, После ус 45 тановления постоянного потенциала(рН) наэлектроде ( 20 мин) записывают показанияпотенциометра (рН-метра).Взаимодействие ферментного препарата с сульфидом и определение остаточной50 ферментной активности,. Ячейку с ферментным препаратом пере носят из буферного раствора в анализируемый раствор следующего состава: 5 мл раствора йа 28 с концентрацией 4,6 10 М и 5 мл 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,0.Инкубируют при перемешивании,Затем ячейку с ферментом переносят вбуфер для промывания и определяют остаточную МАО активность.Для анализа используют тот же метод ите же условия, что для анализа исходнойМАО активности.Находят соотношение показаний потенциометра при анализе исходной и остаточной активности, что является величинойЙ/Й, равной 1,33, Потом находят 1 д О/Й,равный 0,12. По калибровочной кривой вкоординатах 1 д 9,/Й -1(1) с использованиемсеротонина в качестве субстрата находят 1 Оконцентрацию сульфидэ 23 10 э моль/л 10мин. Разделением данной величины на 10находят концентрацию сульфида в анализируемой пробе, т,е. 2,3 10 М,Пример 215Определение исходной МАО активности аналогично примеру 1.Взаимодействие ферментного препарата с сульфидом.Ячейку с 0,4 г ферментного препарата 20переносят из буферного раствора с рН 8,0 ванализируемый раствор следующего соста- "ва: 5 мл раствора сульфида натрия с концентрацией 4,6 10 Ми 5 мл 0,01 Мфосфатногобуфера с рН 8,0; Инкубируют при перемешивании,Определение остаточной МАО активности аналогично исходной МАО активности,Находят соотношение 6/Й, равной 3,9, идалее 1 д Оо/Й 0,59, - 30По калибровочной кривой с использова-.йием серотонина в качестве субстрата находят концентрацию сульфида 2,3 10 М.Приме р 3.Определение исходной МАО активно-.сти аналогично примеру 1.Взаимодействие ферментного препарата с сульфидом,Ячейку с 0,4 г ферментного препаратапереносят из буферного раствора с рН 9,0 в 40анализируемый раствор следующего состава: 5 мл раствора йа 23 с концентрацией4,6 10 и 5 мл 0,01 М фосфатного буфера срН 9,0. Инкубируют в пробе йри перемешивании, Затем ячейку с ферментным препаратом переносят в буфер для промывания и .определяют остаточную МАО активностьаналогично определению исходной МАО активности. Находят соотношение 6/Й, равное 12,1, и далее 1 д О,/Й, равный 1,08,50По калибровочной кривой с использованием серотонина в качестве субстрата находят концентрацию сульфида 2,3 10 э М. Пример 4.Определение исходной МАО активности аналогично примеру 1,Ячейку с ферментсодержащим препаратом переносят из буферного раствора с рН 9,0 в анализируемый состав: 5 мл раствора йа 23 с концентрацией 4 10 М и 5 мл буфера с рН 9,0, Инкубируют с ферментным препаратом при перемешивании. Определяют остаточную МАО активность и находят соотношение /Й, равное 11,8, и далее определяют 1 д до/Й, равный 1,07.По калибровочной кривой с использованием.тирамина в качестве субстр 4 зта находят концентрацию сульфида 2 10 М.Пример 5.Определение сульфидов в сточных водах,Определение исходной МАО активности аналогично примеру 1,Анализируемый состав: 5 мл сточных вод, 5 мл буфера с рН 8,0. Инкубированйе с ферментным препаратом проводят при перемешивании в течение 60 мин при 20 ОС, Соотношение О/Й равно 1,1, Далее определяют 1 д 6,/Й, равный 0,04.По калибровочной кривой с использованием тирамина определяют концентрацию сульфидов, равную 1 10 5 М.Формула изобретенияСпособ определения концентрации сульфидов в физических средах, и редусматривающий отбор пробы среды, внесение ферментного препарата, растворенного в буфере в экспериментальную ячейку, добавление субстрата, выдерживание полученной смеси, определение активности ферментного препарата, последующее внесение ана-. лизируемой пробы в реакционную смесь и повторное определение активности ферментного препарата, расчет соотношения полученных величин активностей фермент-. ного препарата и определение концентрации сульфидов по калибровочному графику, о т л и ч э ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности определения, в качестве ферментного препарата используют биокаталиээтор с моноаминооксидэзной активностью, рК буферного раствора составляет от 7 до 9, а екачестве субстрата используют тирэмин или серотонин.