Способ определения аутоиммунных комплексов липопротеид антитело

(504 С 01 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИДЕТЕЛЬСТВУ РСКОМ нкои иммунологиинение при диагнос именно к клинич может найти приь х просе рдца,в и й боле явлениях емич к клшз ии пе рифе рич их сосуд Целью изобрете ия явл ясоба. повь ти шение точ Способазме) ий ра ви добаве и ивор О,огич ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Научно-исследовательский и ститут экспериментальной медицины АМН СССР(56) Климов А.Н Денисенко А.Д, и др. Обнаружение аутоиммунного комплекса липопротеид-антитело в плазме крови и стенке аорты человека. Вопр. мед. хим, 1978, 9 4, с. 539, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУТОЯММУННЬИ КОМПЛЕКСОВ ЛИПОПРОТЕИД - АНТИТЕЛО (57) Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и может найти применение при диагностике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Целью изобретения является повышение точности определе ния аутоиммунных комплексов липопротеид - антитело. Способ заключается Изобретение относится к медицине тике иммунологических нарушен атеросклерозе и его клиническ 2в том, что указанный комплекс выде - ляют с помощью ультрацентрифугирования в среде с физиологической ионной сипой с плотностью 1,022-1,080 г/мл, затем разделяют на антиген и антитело с помощью повторного ультрацентрифугирования в среде с рН 2,5-3,0 или 10,0-11,0 и с плотностью не меньше, чем при первом ультрацентрифугировании и не больше; 1,080 г/мл и после перевода раствора антител н антигена в среду с нейтральным рН определяют наличие специфических к липопротеидам антител, причем плотность среды при обоих ультрацентрифугированиях доводят до нужных величин с поМощью ра- Ф створов, приготовленных на тяжелойе воде. Положительный эффект изобретения заключается в повышении точности определения аутоиммунных комплексов С липопротеид - антитело при диагностике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний. ный раствор БаС 1, приготовленный н Д 0 до достижения плотности растйвора 1,022-1,080 г/мл, и полученную смесь ульт ра цент рифу г ируют и ри 100000 д в течение 18-22 ч. Суперн таит отсасывают и добавляют к нему буфер с рН 2,5-3,0 или 1 0,0-11,0 с плотностью 1,110 г/мл, также пр готовленный на ДОи подвергают п вторному ультрацентрифугированию 1500008 в течение 5-8 ч. После ул рацентрифугирования нижнюю фракцию переводят в нейтральный рН и испол зуют для определения антител, напмер, с помощью реакции связывания комплемента, реакции пассивной гемагглютинации, иммунодиффуэии, иммуноферментного метода и т.д.П р и м е р 1. К 5 мл сыворотки крови больного А. с ишемической болезнью сердца добавляют 1 мл 0,9 Х- ного раствора БаС 1, приготовленного на Д О, чтобы довести плотность сыворотки до 1, 022 г/мл . Затем сыворотку ультрацентрифугируют в роторе 50.3 на ультрацентрифуге Спинко Е(Бекман, США) в течение 18 ч при 10 С и скорости 40000 об/мин15 (100000 д) . Супернатант, содержащий смесь свободных ЛП и аутоиммунного комплекса (АИК) ЛП-АТ, отсасывают в объеме 1,5 мл и добавляют 4 мл 0,05 М глицинового буфера, приготовленного на ДО, рН 10,0 и плотностью 1,110 г/мл,Результирующая плотность при этом 1,080 г/мл.Образец снова ультрацентрифугируют в роторе БЮ 65 Т 1 на той же ультрацентрифуге при скорости 45000 об/мин (150000 д) в течение 5 ч. После этого из пробирки отсасывают нижние 1,5 мл, содержащие раствор антител, и с помощью 1 М раствора соляной кислоты доводят рН до 7,5. В 30 полученной фракции содержалось 150 мкг иммуноглобулина, который специфически связывался с липопротеидами, как это было установлено в реакции связывания комплемента (в разведении 1:32), в реакции пассивной гемагглютинации (в разведении 1:64), и с помощью иммуноферментного метода (в разведении 1:500)Это свидетельствует о наличии в 40 плазме крови этого больного АИК ЛПАТ и явилось показанием к назначению ему иммунокоррегирующей терапии (Т-активин).П р и м е р 2, К 5 мл сыворотки 45 крови больного Б. с ишемической болезнью сердца было добавлено 8 мл 0,9 Х-ного раствора БаС 1 на ДО, чтобы получить плотность 1,08 г/мл. Затем сыворотку ультрацентрифугируют в роторе 50 Т при скорости 40000 об/мин (1 000008) в течение 22 ч и отбирают верхнюю фракцию (1,5 мл). К этой фракции дооавляют 4 мл буфера Михаэлиса с рН 2,5 и плотностью 3,110 г/мл для получения плотности среды 1,080 г/мл и образец ультрацентрифугируют в роторе Ю 65 Т при скорости 40000 об/мин в течение 8 ч. Затем отбирают нижнюю фракцию, содержащую антитела, и верхнюю фракцию, содержащую липопротеиды (обе фракции в объеме 1,5 мл), и с помощью 1 М раствора гидроокиси натрия доводят рН до 7,5. В полученной фракции антител содержалось 120 мкг иммуноглолубинов, которые специфически реагировали с липопротеидами в реакции связывания комплемента (в разведении 1:8), пассивной гемагглютинации (в разведений 1:32) .Таким образом, в сыворотке крови данного пациента присутствует АИК ЛП-АТ, что послужило поводом для проведения этому больному курса гемо сорбции на активированном угле.Способ позволяет повысить точностьопределения аутоиммунных комплексовлипопротеиц - антитело по сравнениюс методом с использованием ВаЯО всреднем на 353.Формула изобретенияСпособ определения аутоиммунных комплексов липопротеид - антитело путем ультрацентрифугирования сыворотки крови в среде с физиологической ионной силой с последующим отделением супернатанта и разделением иммунных комплексов на антиген и ан-титело и выявлением специфических антител к липопротеидам с помощью тест- системы, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, перед ультрацентрифугированием к сыворотке крови добавляют физиологический раствор с плотностью 1,022-1,080 г/мл, приготовленный на тяжелой воде, а разделение компонентов иммунного комплекса проводят путем добавления к супернатанту буферного раствора с рН 10,0-11,0 или 2,5-3,0 и плотностью не менее, чем плотность супернатанта, и не более 1,080 г/мл, приготовленного на тюкелой воде, далее полученную смесь дополнительно ультрацентрифугируют в течение 5-8 ч, отделяют нижнюю фракцию, содержащую антитела, и нейтрализуют в ней рН.