Способ определения инсулина в эритроцитах

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ц 4 О 01 Я 33/48 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЕЛЬСТВ ВТОРСНОМУ С ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Черновицкий государственный,университет и Черновицкий медицинский институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНСУЛИНА ВЭРИТРОЦИТАХ(57) Изобретение относится к медицине, точнее к эндокринологии, предназначено для сравнения количестваинсулина, связываемого эритроцитамкрови человека и животных в условиях физиологической нормы и при различных нагрузках, Цель изобрете- .ния - повышение точности способа.Для этого пробу крови здорового донора центрифугируют при 2000 д 9)ЯОао 1377 360 мин.Отбирают плазму и слой лейкоцитов.Добавляют к оставшейся эритроцитарной массе физраствор. Центрифугированием отделяют супернатант, повторно отмывают клетки физраствором.Часть эритромассы переносят в физраствор с этанолом в соотношениифизраствор - клетки - этанол 1 ф 1::0,025. Перемешивая, клетки инкубируют 50 мин. Отделяют эритроциты иотбирают 0,15 мл супернатанта, подвергают его электрофорезу в 7 Х-номполиакриламидном геле (рН геля 8,3;трис-глициновая буферная системарН 8,9; сила тока 4 мА на трубку)62 мин до выхода бромфенолового синего из геля, помещенного на 1 ч в1 Х-ный р-р красителя амидо-черного10 Б на 7 Х-ной уксусной кислоте, После отмывания гель денситометрируют на микрофотометре ИФО. Подсчетплощади пика инсулина составляет Э336 усл.ед.1377736 5 О 5 20 25 30 35 40 45 50 ВНИИПИ Заказ 865/40 Тираж 847 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к эндокринологии, и может быть использовано для сравнительного определения количеств инсулина. связываемого эритроцитами крови человека и животных как в условиях физиологической нормы, при проведении различных нагрузок, так и при различной патологии эндокринной и других систем.Цель изобретения - повышение точности способа.П р и м е р 1. 1,5 мл крови здорового донора подвергли центрифу-, гироваиию при 2000 об/мин в течение 1 О мин. Отобрали плазму и слой лейкоцитов. Добавили к 0,6 мл оставшей" ся эоитоомассы 6 мл физиологического раствора, Центрифугированием. отделили супернатант, повторно произвели отмывание клеток физиологическим раствором, 0,5 мл эритроцитарной массы перенесли в физиологический раствор, содержащий этанол в соотношении физиологический раствор клетки - этанол 1:1:0,025 (0,5 мл эритроцитов, 0,5 мл физиологического раствора, содержащего 0,025 мл этанола) . При перемешивании инкубируют клетки в течение 50 мин.Отделили эритроциты и отобрали 0,15 мл супернатанта, Супернатант подвергли электФофорезу в 7%-ном полиакриламидном геле (рН геля 8,3; трис-глициновая буферная система рН 8,9; сила тока 4 мА на трубку. Электрофорез продолжался в течение 62 мин, до выхода бромфенолового синего из геля. Гель помещают на 60 мин в 1 -.ный раствор красителя амидо-черного 1 ОБ на-ной уксус" ной кислоте, излишки красителя отмывают 7 -ной уксусной кислотой. После отмывания гель денситометрируют на микрофотометре ИФО. Пло" щадь пика инсулина составила120 усл,ед.П р и м е р 2. 2,2 мл цельной крови здорового донора центрифугировали и отделили эритроцитарную массу, К 0,9 мл эритромассы добавили 9 мл физиологического раствора. Отделили клетки центрифугированием. Повторили отмывание, добавив к 0,9 млэритроцитов 9 мл физиологическогораствора. 0,7,мл эритроцитарной массы перенесли в физиологический раст"вор, содержащий этанол в соотношении1;1;0,02 0,7 мл эритроцитов, 0,7 млфизиологического раствора, содержащего 0,028 мл этанола). Инкубируютклетки в указанном растворе в течение 50 мин,Отделяют супернатант иподвергают его электрофорезу в полиакриламидном геле аналогично примеру 1. После окрашивания и отмываниягеля проводят денситометрирование.Площадь пика инсулина составила336 чсл.ед. П р и м е р 3. У больного сахарным диабетом взяли 1,6 мл крови.Провели отмывание эритроцитов физиологическим раствором аналогично указанному в примерах .1 и 2. Отобрали 0,5 мл отмытой эритроцитарной массы и подвергли выдерживанию в физиологическом растворе, содержащем этанол. Соотношение клетки " физиологический раствор . - этанол 0,5 мл0,5 мл : 0,025 мл. Время экспозиции составляло 60 мин. Отделили супернатант и 0,15 мл его подвергли электрофорезу. После окраски и обесцвечивания провели денситометрирование геля. Площадь пика инсулина составила 32 усл.ед. Формула изобретения Способ определения инсулина в эритроцитах путем их отмывания и окрашивания, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа, взвесь эритроцитов физиологического раствора и этанола в соотношении 1:1:0,020-0,025 инкубируют в течение 50-60 мин, центрифугируют, супернатант подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле, а содержание инсулина определяют денситометрически.