Способ получения мономерного альбумина плазмы крови

.8) Ри, 1960, НОМЕРем м в раств кис УДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБР ВТОРСКОМУ СВИДЕ(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОГО АЛЬБУМИНА ПЛАЗМЫ КРОВИобработки альбумина цистеинворе и последующей инкубации лой среде, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения выходацелевого продукта, в раствор дополнительно вводят восстановленный глютатион в концентрации (2-6)10Ми этилендиаминтатраацетат в концентрации 10 -10 М при молярном соотношении альбумина и цистеина 1:5001:200, рН доводят до 2,0-2,5, инкубируют 15-20 мин при 4-7 С, затемрН доводят до 7,4-8,0 и последовательно инкубируют 2-3 ч при 36-38 Си 10-15 мин при 50-52 С.1250301 ВНИИПИ Заказ 4356/7 Тираж 660Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Изобретение относится к экспериментальной биохимии и молекулярной биологии, может быть использовано для химической неферментативной очистки препаратов альбумина плазмы крови в биотехнологи экспериментальной и клинической медицине и ветеринарии при получении и применении белковых плазмоэаменителей.Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта за счет дополнительного введения в раствор, которым обрабатывают альбумин, глютатиона и этилендиаминтетраацетата.Способ заключается в растворении альбумина в смеси, содержащей цистеин в концентрации (1-3) 10 М, восстановленный глютатион в концентрации (2-6) 10 М и ЭДТА в концентрации 10 " -10 М при этом, молярное, соотношение альбумин: цистеин составляет 1:500-1:200, полученный раствор подкисляют до рН 2,0-2,5 и инкубируют в течение 15-20 мин прио4-7 С после чего доводят рН среды до 7,4-8,0 и инкубируют сначала при 36-38 С в течение 2-3 ч, а затем при 50-52 С в течение 10-15 мин,П р и м е р 1. 4 мг содержащего примесь жирных кислот человеческого альбумина плазмы крови (Кеапа 1, ВНР)растворили в 1 мл 0,03 М цистеина, содержащего 0,06 М восстановленного глютатиона и 10 Г 1 ЭДТА Г 1 олярное соотношение белка и цистеина составляет 1:500. С помощью О, 1 М НС 1 полученный раствор подкислили до рН 2,0 и инкубировали при 4 С в течение 15 .мин. Затем в раствор добавляли кристаллический трис-буфер до 7,4. Раствор инкубировали при 36 С в течение 2 ч. Затем раствор выдерживалиопри 50 С в течение 10 мин, После охлаждения инкубационной смеси до комнатной температуры ее разбавляли в 2 раза трис-глициновым буфером (рН 8,3), используемым для электро. дов при электрофорезе. Вертикальный электрофорез проводили в 10 -ном полиакриламидном геле, используя для этого микроэлектрофоретическую камеру. Фиксацию и окраску фореграм производили спирт - ацетатным раствором кумасси ярко-синего С -250 на 7 -ном растворе уксусной кислоты. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Количественную оценку результатов фореза производили с помощью микро денситометра МК ЗС. Относительное содержание мономерного альбумина составило по результатам микроденситометрии 88+2,2 .П р и м е р 2, 4 мг лишенного примеси жирных кислот бычьего альбуиина плазмы крови (Репйех, США) растворили в 1 мл 002 М цистеина, содержащего 0,04 М восстановленнбго глютатиона и 210"М ЭДТА. Молярное соотношение белка и цистеина 11300. С помощью 0,1 М НС 1 полученный раст вор подкислили до рН 2,3.Раствор инкубировали при 5 С в течение 17 мин. Затем в раствор добавили кристаллический трис-буфер до рН 7,6.Раствор инкубировали при 37 С в течение 2,5 ч. Затем раствор выдерживали при 51 С в течение 12 мин, После охлаждения инкубированной смеси до комнатной температуры ее разбавляли и подвергали электрофорезу так, как указано в примере 1. Содержание мономерного альбумина составило 97+1,8П р и м е р 3. 4 мг лишенного примеси жирных кислот бычьего айьбумина плазмы крови (Репех, США) растворили в 1 мл 0,01 М цистеина, содержащего 0,02 М восстановленнного глютатиона и 10 4 М ЭДТА. Молярное соотношение белка и цистеина 1:200. С помощью О, 1 Н НС 1 полученный раствор подкислили до рН 2,5 и инкубировали при 7 С в течение 20 мин. Затем в раствор добавляли кристаллический трис-буфер до рН 8,0.Раствор инкубировали при 38 С в течение 3,0 ч. Затем раствор выдерживали при 52 С в течение 15 мин. После охлаждения инкубированной смеси до комнатной температуры ее разбавляли и подвергали электрофорезу, как указано в примере 1. Содержание мономерного альбумина составило 89+ +2,0 .Исполльэование предлагаемого способа позволяет повысить относительное содержание мономерного альбумина в конечном белковом препарате до 90-98 , относительное содержание мономерного альбумина в конечном продукте при сохранении нативнык свойств альбумина, а также сократить время эксперимента до 2-4 ч.