Способ получения смеси милбемицинов, и

ОЮЗ СОВЕТСКИОЦИАЛИСТИЧЕСКЕСПУБЛИК 836426 А 51)5 ЕННОЕ ПАТЕНТ СССР СССР) ОСУДАР ВЕДОМС ГОСПАТ ОБРЕТЕНИЯ(72) Такао ОказакИвадо, Кейдзи Танки Кадзино (3 Р)(56) Патент США И1975,(54) СП НОВ а (57) Исп мышле Сущно штамм аогео 1 а 1190 ку питате углерод 22-30 фильтр 1 Ф 31 ни Лимитед(.1 Р)и, Судзи Танахаси, Сейгоака, Тосиаки Янаи и Хиса 950360, кл, 549-264 получеа 1 з. а енным ротив обой макзвестным ругим по- структуичленном ся путем рганизмаолучения ных проДля того, чтобы избежать недоразуме ний, далее в тексте приводятся ссылки на формулу(А) гипотетического родового веще ства, в которой дана нумерация некоторых атомов углерода: сн О зОПИСАНИЕК ПАТЕНТУ Изобретение касается способ ния смеси милбемицинов а 11, а 1 г а 15, веществ, которые обладают акарицидной, инсектицидной и гельминтной активностями,Эти вещества представляют с ролиды, химически родственные и милбемицинам, авермектинам и д добным соединениям. Они имеют ру, основанную на шестнадцат макролидном цикле, и получают ферментации различными микроо ми или полусинтетически, путем и производных таких ферментацион дуктов,ОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИЛБЕМИЦИ, а 1 г,а 1 э,а 14 и а 15ольэование; фармацевтическая пронность, ветеринария и медицина, сть способа заключается в том, что 31 гертоеусез пудгозсорсоз заЬзр. сг 1 лтоз 11 з,. ЯАМК 6028 РЕЯМ ВР - льтивируют в азробных условиях в льной среде, содержащей источники а, азота, в течение 5 - 15 дней при С и выделяют целевой продукт из ата культуральной жидкости, 3 табл,. Все различные классы известных макролидных соединений, родственных милбемицину, обладают одним или несколькими а типами активности в качестве антибиотика, антигельминтного, эктопаразитицидного, акарицидного или другого пестицидного агентов. Однако, пока еще существует необходимость в обеспечении веществ с моди- ф фицированной активностью против одного или нескольких классов паразитов,Целью изобретения является предо- в ставление макролидных веществ, имеющих Об модифицированную паразитицидную ак д тивность, и обеспечение способа получения (,Ь таких веществ. 3 ьБыло обнаружено, что активность производных милбемицина может быть моди- р, фицирована путем введения ненасыщенной сложноэфирной группы в положение, вместо 4 - метильной группы. Конкретно, настоящее изобретение обеспечивает 26-алкеноилокси-производные милбемицина и родственных макролидов.Таким образом, изобретение обеспечивает вещества, имеющие формулу ЯСледуя одной из соответствующих методик примеров 2-5 были получены следующие соединения,П р и м е р 6. 26-(2-Метил-бутеноилокси)милбемицин А 1(соединение В 6)Масс-спектр (метод электронной бомбардировки, в/г);640 (М ), 604, 540, 522, 414 .Спектр ядерного магнитного резонанса(270Гц, СООз, ч/млн).1,80 (ЗН, дублет, 3 = 7,2 Гц, СНз-СН=С(СНз)СОО-)1,85 (ЗН, синглет, СНз-СН=С(СНз)-СОО-)3,08 (1 Н, дублет триплетов,",3 = 2,4, 9,3 Гц,С 25 Н)4,73 (1 Н, дублет Э = 13,7 Гц 1,С 26 Н)П р и м е р 7 26-(2-Гексеноилокси)милбемицин А 4 (соединение Из 7)Масс-спектр (метод электронной бомбардировки, в/г);654 (М ) 618 522 504 414, 396(СНз(2 СН-СН=СН-СОО-)П р и м е р 9. 26-(3-Гексеноилокси)милбемицин А (соединение М 9)Масс-спектр(метод электронной бомбардировки,вй):654 (М ), 414, 279, 195, 167Спектр ядерного магнитного резонанса(270мГц, СООз, ч/млн):3,07 (2 Н, дублет, 3 = 6,4 Гц СН 2 - СН 5=-СНО+СОО- )4,68 (1 Н, дублет, 1 = 12,9 Гц, С 26 Н)4,79 (1 Н, дублет 3 = 12,9 Г 2, С 26 Н)П р и м е р 10. 26-(4-Пентеноипокси)мипбемицин А (соединение Мг 10)Масс-спектр (метод электронной бомбардировки, в/ф 640 (М ), 604, 522. 264, 195, 167Спектр ядерного магнитного резонанса(270мгц, СОСз, ч/млн):3,07 (1 Н, дублет триплетов, 3 = 2,4, 9,3 Гц,С 25 Н)4,69 (1 Н, дублет 3 = 13,7 Гц, С 26 Н)4,79(1 Н, дублет, Л "13,7 Гц, С 26 Н)4,99-5, 10 (2 Н, мул ьти и л е т, С Н 2=СН СН 2 СН 2-СОО-)П р и м е р 11. 26-Циннамоилоксимилбемицин Аа(соединение М 11)Масс-спектр (метод электронной бомбарди ровки в/г)688 (М), 652, 522, 276, 195, 167Спектр ядерного магнитного резонанса (270мГц, СООз, ч/млн):3,07 (1 Н, дублет триплетов, 1 = 2,4, 9,7 Гц, 20 СЖН)4,81 (1 Н, дублет, 3 - 13,3 Гц, С 26 Н)4,89 (1 Н, дублет, 1 = 13,3 Гц, СиН)6,47 (1 Н, дублет, 3 = 16,1 Гц, РЬ - СН=СН -СОО-)25 7,72 (1 Н, дублет, 1 = 16.1 Гц, Рп-СН=СНСОО-)П р и м е р 12. 26-Пара-хлорциннамоилоксимилбемицин А 4 (соединение М 12)Масс-спектр (метод электронной бомбарди ровки в/г)722(Мз),704,540,522,504 ;Спектр ядерного магнитного резонанса (270мГц, СООз, ч/млн):3,07 (1 Н, дублет триплетов, 3 = 2,4, 8,9 Гц, 35 С 25 Н)4,81 (1 Н, дублет 3 = 13,3 Гц, С 26 Н)4,93 (1 Н, дублет, 3 = 13,3 Гц, С 26 Н)6,44 (1 Н, дублет, 3 = 16.1 Гц, пара-О-РпСН=СН-СОО-)40 7,67 (1 Н, дублет, 3 = 16,1 Гц, пара-О-РпСН.=СН-СО О - )П р и м е р 135-0-Пропионил-(З-метил-бутеноилокси)милбемицин А 4 (соединение М 14)45 Масс-спектр (метод электронной бомбардировки, в/г):696 (М ), 604, 504, 414, 396, 356, 264, 195,167, 151Спектр ядерного магнитного резонанса(270 50 мГц, СООз, ч/млн):1,15 (ЗН,триплет, 1 = 7,6 Гц, СНрСН 2 СО-)2,40 (2 Н, квартет/ = 7,6 Гц, СНзСНгСО-)3,07 (1 Н, широкий триплет, 3 = 8,0 Гц, С 25 Н)4,11 (1 Н, дублет, 3 = 6,0 Гц, СвН)55 4,50-4,76 (4 Н, мультиплет, С 2 вН, СпН)5,65-5,95 (5 Н, мультиплет, СзН, С 5 Н, С 9 Н,С 1 оН). (СНз)2 С=СН-СОО-)П р и м е р 14, 5-0-Этоксикарбонил-(3 метил-бутеноилокси)милбемицин И;,(соединение М 15)40 45 50 55 Масс-спектр (метод электронной бомбардировки, т/г);712 (М ), 414, 396, 264, 195, 167, 151 Спектр ядерного магнитного резонанса (270 мГц, СОСэ, ч/млн):1,31(ЗН, триплет,=7,1 Гц, СНзСН 2 ОСОО-) 3,07 (1 Н, дублет триплетов = 2,4, 8,9 Гц, СжН)4,14 (1 Н, дублет, Л = 6,1 Гц, С 6 Н)4,19 (2 Н, квартет,=7,1 Гц, СНЗСН 2 ОСОО-) 4,57 - 4,76 (4 Н, мультиплет, С 26 Н, С 27 Н) 5,54 (1 Н, дублет дублетов 3 = 1,6, 6,1 Гц, С 5 Н)П р и м е р 15. 26-(3-Метил-бутеноилокси)ивермектин Ви (соединение В 17) Масс-спектр (метод ГАВ, добавлен триэтаноламин, щ/г):1014, 992,.978, 962, 934, 878, 830, 299, 194 Спектр ядерного магнитного резонанса(270 мГц, СООз, ч/млн);3,07 - 3,29 (ЗН, мультиплет, С 4, Н, С 4 Н, Сг 5 Н) 3,35(1 Н, синглет, С 2 Н)3,48 (6 Н, синглет, два-ОСНз)3,97(1 Н, дублет, Л = 6,1 Гц, СвН)4,49 (1 Н, широкий синглет, С 5 Н)4,69 (2 Н, широкий синглет, С 27 Н)4,97 (1 Н, широкий дублет, Л = 7,3 Гц, С 5 Н)П р и м е р 16. 26 - (3-Метил-бутеноилокси)Я - 541 А (соединение М 20)Масс-спектр (метод электронной бомбардировки. п/г);710 (М ), 592, 523, 468, 448, 423, 376 Спектр ядерного магнитного резонанса (270 мГц, СОС 1 з, ч/млн):3,75(1 Н, дублет, Л =10,9 Гц, С 25 Н)4,67(1 Н, дублет, Л =13,3 Гц, С 26 Н)4,82 (1 Н, дублет,= 13,3 Гц, Сг 6 Н)5,20(1 Н, дублет, Л = 8,9 Гц, СэгН)П р и м е р 17. Испытания активности: Взрослые клещиБыли приготовлены образцы растворов, каждый из которых содержал 0,3 ч/млн, 1 ч/млн или 3 ч/млн индивидуальных соединений настоящего изобретения, или одно иэ трех контрольных соединений (милбемицин С, смесь милбемицина С и милбемицина Сг, описанная в патенте Японии 29742-84;26-ацетоксимилбемицин А 4; или 26-ацетоксиавермектин В 1 а) и 0,01; спредера.Дву-пятнистые паукообразные клещи (Тетгапусйоз ог 11 сае), чувствительные к органо-фосфорным инсектицидам, инокулировали на первичный лист растений вигны китайской (ЧЬпа з 1 пепз 3 Зач 1). Через день после инокуляции с помощью вращательно 5 10 15 20 25 30 35 го разбрыэгивателя распределяли 7 мл образца раствора, указанного выше (разбрызгиватель фирмы М 1 гиИо Яе 1 заКцзЬо Со.) с получением распределенного количества 3,5 мг/см листа. После разбрызгивания лист оставляли при комнатной температуре при 25 С, Через три дня с помощью бинокулярного микроскопа оценивали состояние взрослых насекомых и смертность (%) рассчитывали. Результаты приведены в табл, 2,П р и м е р 18, Испытания активности: яйца клещейБыли приготовлены образцы растворов, каждый из которых содержал 1 ч/млн или 3 ч/млн индивидуальных соединений настоящего изобретения, или одного из трех контрольных соединений (милбемицин С, смесь милбемицина С и милбемицина С 2, описанная в патенте Японии 29742 - 84; 26-ацетоксимилбемицин А 4; или 26-ацетоксиавермектин Ва) и 0,01% спредера.Самкам дву-пятнистых паукообразных клещей позволяли откладывать яйца на первичном листе растений вигны китайской. Взрослых клещей удаляли с получением листьев для испытания с отложенными на них 50 яйцами,К испытуемым листьям применили образцы растворов по способу, описанному выше в примере 17. После 2-недельного нахождения в комнате при температуре 25 С сосчитывали число не созревших яиц (число не вылупившихся особей) и оценивали их в процентах, Результаты представлены втабл, 3,Таким образом было показано, что новые милбемицины настоящего изобретения показали высокую акарицидную активность против взрослых клещей при такой низкой концентрации, как 0.3 ч/млн, а также проявили полезную овицидальную активность.Формула изобретения Способ получения смеси милбемицинов гг 1, гг а, а з, сг а и а 5, заключающийся в том, что штамм 51 гертогпусез Ьу 9 гозсор 1 соз зоЬзр, агеоасг 1 возоз БАЗАК 60286, ГККМ ВРкультивируют в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, в течение 5-15 дней при температуре 22-30 С и выделяют целевой продукт из фильтрата культурал ьн ой жидкости.1836426 23 Таблица 1 Свойство Ха акте истики Сеа рост аэриальный мицелийобратная поверхность аство .имый пигмент нет очень хороший, желтовато - серыйрост агар аэриальный мицелийобратная поверхность аство имый пигмент хороший, серовато-белый (М) светло - желтая (3-9-10)рост аэриальный мицелий обратная поверхность аствооимый пигмент нет Иеорганическая соль-крахмальный агар (1 ЗР 4)рост аэриальный мицелий обратная поверхность аство имый пигмент нет рост аэриальный мицелий обратная поверхность аство имый пигмент нет рост аэриальный мицелийобратная поверхность аство имый пигмент нет рост аэриальный мицелий братная поверхнос мый пигмент нет Сахарно - нитратный агар Глюкоза - аспарагиновый Тирозиновый агархороший, светлый оливковосерый ( 2-8-11 ) хороший, от белого до свет ло-желтого ( 3-9-10 )светло-желтая ( 6-8-10 ) хороший, желтовато-серый ( 2-9-12 ) хороший, белый желтовато-серая ( 4-9-11)26 1836426 Продолжение табл,Ха акте истики Свойство рост солодовый экстрактаэриальный мицелий обратная поверхность светло-желтый ( 8-9-12 ) растворимый пигмент Агар овсяной мукирост лый (М) еровато-белый едный одный ага ос аэриальный мицелий онезначительно вание, светлыи коричнево-серый (2-8-9 )белая (Мров ная поверхность о имый пигмент ро ыи Агар карто кстракт - м ыи эриальныи ми акт атная поверхнос-9 аство имый пигм оиств ологиче Физиологически ойства штамма ЗАИК 60286 показаны ниже,Гидролиз крахмалаОжижение желатина положит положительное ( слабое положительное положительная (слабояановление ни ция молока ( при 28 и 37 ) зация молока(при 28 и 37 С1И р л температур роста (среда 1) , Образование меланоидного пигмент(слаб оложите Среда Агар дрожжевой экстракт Во Коагуля Пептони нте ва очень хороший, желтоватокоричневый ( 2-9-11 ) обильный, серовато-белыйаэриальный мицелий обильный, серовато-беобратная поверхность желтовато-коричневая растворимый пигмент светлый оливково-себедный, серовато-белы27; 1836426 2) Таблица 2 рргл - ч/мл Таблица 3 Среда 1, ага среда 2: тр среда 3: аг среда 4; ти р дрожжевой зк птон-дрожжевой р пептон дрожж озиновый агар тракт-солодовый экстракт г я экстракт-бульон1 ЗР 1) вой экстракт-железо (1 ЯР 6 1 БР 7) Продолжение табл. 130 1836426 Продолжение табл, 3 Редактор О,Кравцо Заказ 3008 Тираж Подписное 8 НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101 Составите Техред М Т.Лукачевыхргентал Корресн Сн фХ в которой: -Х-У-представляет собой -СН 2- СН 2, СН 2-СНОН СН СН- или -СН С(=О)- В 1 аредставляет собой метильную группу, этильную группу, вторичную бутильную группу ипи группу формулы -С(СНз)=СНВ 5, в которой В 5 представляет собой метильную группу, этильну)о группу или изопропильную группу; В 2 представляет собой группу формулы: -(СН 2)-С(В 6)=С(Й 7)(йа), в которой и представляет собой О, 1 Или 2, Вб и Вт каждый представляет собой атом водорода или 2 метильную группу, и В 8 является атомом водорода, апкильной группой С 1-С 4, фенильной группой, или фенильной группой, замещенной одним или более атомов гало- гена, метильной или нитрогруппами; Йз 2 представляет собой атом водорода, метильную группу, гидрокси-защищающую группу или остаток, образующий сложный эфир карбоновой кислоты, ипи кислотный остаток; и В 4 представляет собой атом водорода 3 или альфа-олеандросил-апьфв+олеандросилокси-группу, при условии, что Я 4 представляет собой атом водорода, когда группа Й 1 представляет собой метильную группу, этильную группу, или группу формулы - 3 С(СНз)=СНВБ, в которой В 5 является метильной группой, этильной группой или изопропильной группой.Вещество по изобретению может использоваться в паразитицидной композиции, ко торая может иметь антигельминтную, акарицидную, инсектицидную или прочую активность. Эта композиция. включает вещество формулы Щ в смеси с фармацевтически, сельскохозяйственно; ветеринарно или са доводчески приемлемым носителем ипи разбавителем. чески, имеет разветвленный от светло-желтого до желтовато-коричневого основной мицелий, из которого удлиняется от белого до желтовато-серого аэриальный мицелий 60 со спиральными терминалами, В растущейцепочке спор наблюдаются 10 или более спор в линию, причем споры имеют бородавчато-морщинистую поверхность. Этот штамм образует в некоторых типах сред прозрачную золотую слизь на поверхности аэриального мицелия, причем эта слизь изние обеспечииту животныхий от поврежми из акари, причем этотили назначеванным живоили семенам есто обитания й или семян,Кроме того, это изобрете вдет также обработку или защ (в том числе людей) ипи растен дения паразитами, выбранны дов, гельминтов и насекомых способ включает применение ние вещества формулы (1) наз тным, указанным растениям указанных растений, или на м указанных животных, растен Некоторые из веществ формулымогутбыть получены как ферментационные продукты.Изобретение обеспечивает способ получения вещества формулы (1), в которой - Х -У- представляет собой группу -СН 2 - СН 2-:Вз и В 4 каждый представляет собой агомводорода; и 1) В 1 является метильной группой, а В 2 представляет собой 2-метил-пропенильную группу, 2) В 1 является метильнойгруппой, и В 2 представляет 2-метил-бутенильную группу, или 3) В 1 явпяется атил ьнойгруппой, а В 2 представляет собой 2-метиппропенипьную группу,Здесь такие вещества называются ми:".- бемицинами альфа 11 (возможность 1), приведенная выше), апьфа 1 з (возможность 2),приведенная выше) и апьфа 14 (возможность0 3), данная выше). Они могут быть полученыпутем культивирования продуктивных микроорганизмов рода Я 1 гер 1 огпусез. Такоймикроорганизм представляет собой штаммЯАИК 60286, принадлежащий к роду5 Я 1 гертоаусез, который был выделен из почвы города Миура, префектура Канагава,Япония,Милбемицины альфа 11, альфа 1 з и альфа 14 образуют часть ряда веществ, которые0 выделены из ферментационного бульонаЯ 1 гертогпусез штамм ЗАИК 60286 и названымилбемицинами от апьфа 11 до альфа 15, какпоказано ниже;В 1 В 25 апьфа 11 метил 2-метил-пропенипапьфа 12 мстил изобутилальфа 1 з метил 2-метил-бутенилапьфа 14 атил 2-метил-пропенилальфа 15 атил изобутил0 Характеристики Ясгер 1 оп 1 усез ЗАИК60286Микологические свойства актиномицетов штамма ЗАИК 60286 приведены ниже,1. Морфологические характеристики.б Этот штамм, как показано микроскопименяется до желтоватых пятен в процессе культивирования. Иногда образуются чер 1836426новатые пятна вследствие влажности на поздней стадии культуры.2. Рост на различных средахЭтот штамм проявляет свойства, которые показаны в табл, 1 после культивирова ния при 28 С в течение 14 суток на различных средах. Использованные здесь названия цветов и номера были приписаны на основании "Правила по стандарту цвета", - справочника, опубликованного фирмой "Ниппон Шикисай Кенкюшо",После культивирования при 28 С в течение 14 суток на среде Придхам-Готтлибоваагара, для штамма ЗАИК 60286 отмеченоиспользование источником углерода, какпоказано ниже,Сахар ИспользованиеО-глюкоза1:арабинозаО-ксилоза +изо-инозитолО-маннитолО-фруктоза1-рамн озасахарозараффин озаконтрольхорошо используется+ используется- не используется4, Клеточные компонентыСтенка клеток штамма ЗАИК 60286 была исследована в соответствии со способом,описанным В,Вес 1 ег с сотрудниками в журнале(АррНед М 1 сгоЫооду 12,421(1964). Таккак 1, 1-диаминопимелиновая кислота и глицин могут быть детектированы, было показано, что клеточная стенка относится кстенке типа 1. Затем сахарные компонентыво всех клетках были исследованы согласнометоду, описанному М, Р,1 есЬеча1 ег в журнале (, от 1 аоогатогу апс 1 С 11 пса 1 Мео 1 с 1 пе, 451968, том; 71, 934), Не наблюдалось никакиххарактеристичных структур,В итоге, было показано, что этот штаммпринадлежит к роду Ятгер 1 овусез актиномицетов, 50Идентификация 5 тгер 1 овусез штаммЗАИК 60286 была осуществлена в соответствии со стандартом бР (МеждународнаяПрограмма Зтгерсовусез); Бергеевскимсправочником определительной бактериологии; восьмое издание; книгой 3.А.Юа 1 звап, "АсОповусе 1 ез"; и другими недавнимиработами по актиномицетам.Когда свойства штамма ЗАИК 60286 были сопоставлены с таковыми для других известных видов рода Бтгерювусез, то морфологические и физиологические свойства были почти идентичны таковым для Я(герсовусез Ьудгозсор 1 сцз субспоры аогеоасг 1 возоз (1. Апт 1 Ыобсз, том. 36, 438 (1983).Однако наблюдалось небольшое различие в свойствах культур между этими двумя штаммами. Хорошо известно, что свойства актиномицетов изменяются в некоторой степени даже для того ке самого штамма после нескольких последовательных выращиваний. Поэтому штаммы не всегда могут быть дифференцированы таксономически из-за небольшого различия в свойствах культуры,По этим причинам, штамм ЗАИК 60286, который продуцирует милбемицины альфа, альфа 12, альфаз, альфам и альфа 1 з, был идентифицирован как Зтгерювусез Ьудгозсор 1 сцз субспоры аогео 1 асг 1 воыз ЯАКК 60286. Этот штамм был депонирован в соответствии с постановлением Будапештского Договора от 20 октября 1986 г., при Исследовательском институте ферментации, Япония, причем ему присвоен вступительный номер ГЕРМ ВР - 1190, Образцы этого штамма могут быть доступны по соответствующим постановлениям Будапештского Договора.Актиномицеты,включающие 31 герЫвусез Ьудгозсор 1 соз субспоры аогео 1 асбвозцз ЯАКК 60286, легко претерпевают мутацию как в результате естественных факторов, так и в результате искусственных обработок, таких как ультрафиолетовое облучение, радиационная обработка и химическая обработка.Настоящее изобретение охватывает все продуктивные мутанты штамма БАЙК 60286, Эти мутантные штаммы также включают любые штаммы, которые получают генным манипулированием, таким как генная рекомбинация, трансдукция и трансформация, Иными словами, это изобретение включает все такие штаммы, которые могут производить один или несколько милбемицинов альфа 1, альфа 1 з и альфам, и особенно штаммы, которые не могут быть четко дифференцированы от штамма ЗАИК 60286 или его мутантов,Милбемицины альфац, альфа 1 з и альфа 14 могут быть получены путем культифирования штамма ЯАМК 60286 в подходящей среде и путем отбора милбемицинов из этой среды. В качестве питательных веществ могут быть использованы традиционные соединения, которые обычно применяются для выращивания микроорганизмов рода31 гер 1 оглусез, Например, источником углерода может быть глюкоза, сахароза, крахмал, глицерин, густой солодовый сироп, моляссы или соевое масло. Кроме того для примера, источником азота может быть соевый порошок, пшеничные зерна, мясной экстракт, пентон, дрожжевые клетки, жидкость для замачивания кукурузы, сульфат аммония или нитрат натрия. В случае необ ходимости, в подходящем сочетании могут быть использованы органические и неорганические добавки, которые промотируют рост микроорганизмов и активируют производство милбемицинов альфа 11, альфа 1 з и альфа 14, а также неорганические соли, такие как карбонат кальция, хлорид натрия и Фосфаты.Наиболее пригодным для культивирования микроорганизмов является жидкостное выращивание, в особенности глубокая жидкостная культура, которая используется таким же способом, как и в традиционных способах получения антибиотиков. Выращивание проводится аэробно. Подходящая температура для выращивания составляет от 22 С до 30 С, причем в большинстве случаев выращивание проводится около 28 С. Производство милбемицинов альфа 11, альфа 1 з и альфа 14 обычно достигает максимума через 5-15 суток или при выращивании со встряхиванием, или при выращивании в емкости,Получение милбемицинав альфа 11, альФа 1 з и альфа 14 может быть прослежено с помощью следующей методики. Один миллилитр культивируемого материала отбирают в небольшую пробирку и добавляот 9 мл 8070-ного водного метанола. Пробирку встряхивают и центрифугируют, Используют жидкостную хроматографию высокого разрешения (такую как Зйч - 2151, колонка с обратной фазой Оу-Ди-Ос размером 6 х 150 мм, фирма Сеншу Ко, и насос фирмы Хитачи, модель 655). Вводят дозу 5 мкл образца и элюируют ее смешанным растворителем из ацетонитрила и воды (80: 20) при скорости потока 1,5 мл/мин. Милбемицины альфа 11, альфа 1 з и альфа 14, регистрируются с помощью блока обработки данных (такого как Эм-Си-Пи-ДиЙи-Си фирмы Юнион Тех, Инструм.).Для отбора милбемицинов вльфа 11, альфа 1 з и альфа 14 из культурной среды может использоваться адсорбент, такой как активный углерод, оксид алюминия или силикагель; синтетический адсорбент, такой как Диаион Эйч-.Пи(фирма Мицубиши Хем. Инд. Лтд,) адсорбент, такой как Авицел(Теюапусйнз), цитрусового красного клещика (Рапопусйнз), Европейского красного клещика и ржавчинных клещиков, которые являются паразитами для фруктовых деревьев, овощей и цветущих растений и против 1 хоб, Оегеапуззбе, Яагсорт 1 бае и других паразитов, которые паразитируют на животных. Кроме того, эти вещества обладают активностью против Оезтгнз, Ыссйа, Нуробегеа, ОантгорЫнз, блох и вшей, среди которых другие являются паразитами в Отношении животных и птиц домашних на(фирма Асахи Хем. Инд. Ко, Лтд) или фильтровальная бумага; ионообменная смола; или фильтрующий материал ионообменного геля, Наиболее эффективна следующая ме тодика,Культивируемый материал фильтруетсяс использованием фильтрующего средства, такого как диатомит. Полученная при фильтровании лепешка экстрагируется метано- "0 лом, для того. чтобы растворить целевыесоединения в водном метаноле, Добавляют воду, и смесь экстрагируют гексаном. Гексановый раствор выпаривают при пониженном давлении, получая маслянистое вещество, которое содержит милбемици;:; альфа 11, альфа 1 з и альфам, Это маслянистое вещество, содержащее милбемицины альфа 11, альфа 1 з и альфа 14, адсорбируют на колонке Лобар Я 60 (фирм;: Мерк, размер Би) и эл 1 оируют его смешанным растворителем из гексана и этилацетата (80: 20), отбирая фракции, каждая из которых содержит милбемицины альфа 11. альфа 1 з или альфа 14, 25 Каждую Фракцию, содержащую любой измилбемицинов, выпаривают при пониженном давлении, получая маслянистое веще.ство. Это масло смешивают с небольшим количеством метанола, адсорбируют раствор на колонке Лобар Рр - Ми(фирма Мерк, размер Би) и элюируют смешанным растворителем из ацетонитрила и воды (80: 20). Собирают фракции, каждая из которых содержит одно из целевых веществ, и после отгонки ацетонитрила при пониженном давлении экстрагируют этилацетатом. Окончательно каждый из милбемицинов альфа 11, альфа 1 з и альфа 14 может быть получен в аиде порошка методом жидкостной хрома тографии высокого разрешения (колонка собратной фазой). Милбемицины альфа 12 и альфа 15 также могут быть получены аналогичным образом.Вещества формулы Щ этого изобрете ния обладают превосходной акарициднойактивностью против взрослых особей и яиц двупятн истого паутин ного клещикасекомых, такие как тараканы, домашние мухи и других насекомых; и различных насекомых, вредоносных для сельскохозяйственных и садовых культур, таких как тля, капустная моль и гусеница .ерЫорсегэ. Кроме того, вещества этого изобретения обладают активностью против МеоЫоцупе, Вогзарйеепсйоз, РЫго 4 урМз и других видов в почве,Кроме того, вещества этого изобретения обладают превосходной паразитицидной активностью против эндопаразитов животных и человека. В особенности эти вещества являются эффективными не только против нематод, паразитирующих на домашних животных и домашних птицах и животных, таких как свинья, овцы, козы, крупный рогатый скот, лошади, собаки, кошки и пернатая дичь, но также против паразитов. обнаруженных в пищеварительных трактах, крови и других тканях и организмах людей и паразитов, принадлежащих к роду Р 1 эгПдае или ЯеагИбае.Когда вещества этого изобретения предназначаются для использования в сельскохозяйственных или садоводческих целях. они могут составляться в виде препаратов, которые традиционно использовались для сельскохозяйственных химикалиев, таких как дусты, увлажняющиеся порошки, эмульгирующиеся концентраты, водные или маслянистые суспензии и аэрозоли, путем смешивания их с носителями или другими вспомогательными агентами в случае необходимости. Носители могут быть природными или синтетическими и неорганическими, или органическими веществами, которые вводятся в сельскохозяйственные рецептуры для того, чтобы способствовать достижению цели активным компонентом исделать его более удобным для хранения, транспорта и обращения с активным ингредиентом,Что касается удобных твердых носителей, здесь могут быть упомянуты неорганические вещества, такие как глины (например, каолинит, монтмориллонит и аттапульгит) тальк, слюда, пирофилит, пемза, вермикулит, гипс, карбонат кальция, доломит, диатомитовая земля, карбонэт магния, апатит. цеолит, кремниевый ангидрид и синтетический силикат кальция; растительные органические вещества, такие как соевый порошок. табачная пыль. ореховая пыль, пшеничная мука, древесная мука, крахмал икристаллическая целлюлоза; синтетические или природные высокомолекулярные вещества, такие как кумароновые смолы, нефтяные смолы, алкидные смолы, поливинилхлорид, полиалкиленгликоли, кетоновые смолы, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 сложноэфирные смолы, смолы камеди и даммаровые смоль.; воски, экие как воск карнаубы и пчелинный воск; и мочевина.Что касается жидких чосителей, то здесь могут быть упомянуты парафиновые или нафтеновые углеводороды, такие как керосин, минеральные масла, веретенное масло и белые масла; ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол, ксилол, этилбензол, кумол и метилнафталин; хлорированные углеводороды, такие как четыреххлористый углерод, хлороформ, трихлорэтилен, монохлорбенэол и ортохлортолуол; простые эфиры, такие как диоксан и тетрагидрофуран; кетоны, такие как ацетон, метилэтилкетон, диизобутилкетон, циклогексанон, эцетофенон и изофорон; сложные эфиры, такие как зтилацетат, амилацетат, этиленгликоль-ацетэт, ацетат диэтиленгликоля, дибутилмалеат, диэтилсукцинат; спирты, такие как метанол, н-гексанол, этиленгликоль, диэтиленгликоль, циклогексанол и бензиловый спирт; простые эфиры спиртов,. такие как этиловый эфир этиленгликоля, фениловый эфир этиленгликоля, этиловый эфир диэтиленгликоля и бутиловый эфир диэтиленгликоля; полярные растворители, такие как диметилформамид и диметилсульфоксид; и вода,Что касается подходящих газообразных носителей, то могут быть упомянуты воздух, диоксид углерода и фреон (торговая марка), Эти газы могут быть смешаны для распыления.Для того чтобы улучшить такие свойства рецептуры, как диспергирование, змульгирование, распространение, проникновение и прилипание, в случае необходимости могут быть добавлены различного типа поверхностно активные агенты и высокомолекулярные соединения, посредством которых могут быть усилены увлажняемость, адгезия и эдсорбция рецептуры на животных и растениях для повышения их эффективности.Что касается поверхностно-активных агентов, котооые могут применяться для эмульгирования, диспергировэния, увлажнения, распространения. связывания, регулирования измельчения, стабилизации активных компонентов, улучшения текучести и предотвращения образования ржавчины, то могут использоваться любые неионные, анионные, катионные и амфотерные типы, но среди них обычно используются неионные иили анионные поверхностно-активные агенты. Что касается пригодных неионных поверхностно-активных агентов, то здесь могут быть упомянуты, например, полимериза 1836426 12ционные аддукты оксида этилена с высшими спиртами, такими как дуариловый спирт, стеариловый спирт и олеалиловый спирт; полимеризационные аддукты оксида этилена с алкилфенолами, такие как изо-октилфенол и нонилфенол, полимеризационные аддукты оксида этилена с алкилнафтолами, такими как бутилнафтол и октилнафтол; полимеризационные аддукты оксида этилена с высшими жирными кислотами, такими как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и олеиновая кислота; полимеризационные аддукты оксида этилена с моно- и диалкилфосфорной кислотой, такой как стеарилфосфорная кислота и дилаурилфосфорная кислота; полимеризационные аддукты оксида этилена с аминами, такими как додециламин и стеариламин;сложные эфиры высших жирных кислот и многоатомных спиртов, таких как сорбит и их полимеризационные аддукты с оксидом этилена; и полимеризационные аддукты оксида этилена с оксидом пропилена. Что касается подходящих анионных поверхностно-активных агентов, то здесь могут быть упомянуты, например, соли алкилсульфата (сложный эфир), также как натрийлаурилсульфат и аминовые соли сложного эфира олеилового спирта и серной кислоты; алкилсульфонаты, такие как натриевая соль диоктилового эфира сульфоянтарной кислоты и натрий- этилгексенсульфонат; и арилсульфонаты, такие как натрий-изопропилнафталинсульфонат, натрий-метилен-биснафталинсульфонат. натрий-лигнинсульфонат и натрий-додецилбензолсульфонат.Для того, чтобы улучшить свойства рецептуры и усилить биологический эффект, композиции этого изобретения могут использоваться в сочетании с высокомолекулярными соединениями или другими вспомогательными веществами, такими как казеин, желатин, альбумин, клей, альгинат .натрия, карбоксиметилцеллюлоза, метил- целлюлоза, гидроксиэтилацеллюлоза и поливиниловый спирт,Упомянутые выше носители и различные вспомогательные вещества могут быть использованы как таковые или в любом желаемом сочетании, в зависимости от типа рецептуры, цели применения и тому подобных факторов.Дусты могут содержать, например, от.1 до 25 мас,% активного компонента, вообще, причем твердый носитель составляет остальное,Увлакняемые порошки могут содержать, например, от 10 до 90 мас, о активного компонента, вообще, причем твердый . 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 носитель и диспергирукиций и увлажняющий агент составляют остальную часть, В случае необходимости, могут быть добавлены защитный коллоидный агент, тиксотропный агент и противовспенивающий агент. Эмульгирующиеся концентраты могутсодержать, например, от 5 до 50 мас,;активного компонента, вообще, и от 5 до 20мас. О/О эмульгирующегося агента, причемжидкий носитель составляет остальное, Вслучае необходимости, может быть добавлен антикоррозионный агент,Маслянистые рецептуры вообще могутсодержать, например, от 0,5 до 5 мас, оактивного компонента, причем жидкий ньситель, такой как керосин, составляет остальную часть.Аэрозоли вообще могут содержать, например, от 0,1 до 5 мас, активного компонента, и необязательно душистое вещество,причем маслянистый и/или жидкий носитель составляет остальную часть, Распылители, такие как сжиженный нефтяной газ,фторуглеродный газ и диоксид углерода могут бь.ть загружены в рецептуру.После того, как различным образом составлена рецептура, как упомянуто выше,композиция этого изобретения может бытьэффективно нанесена на культуры и на домашних животных, на которых паразитируют вредные насекомые или клещи, нарисовых полях, фруктовых садах и нагорныхполях, путем обработки стеблей и листьевкультурных растений, почвы или домашнихживотных при концентрациях от 0,5 до 100ч, на миллион активного компонента.Когда вещества этого изобретенияпредназначаются для использования наживотных или людях в качестве противогельминтного агента, то эти вещества могутбыть заданы перорально в виде напитка.Обычно напиток является раствором, суспензией или дисперсией с подходящим нетоксичным растворителем или водой,вместе с суспендирующим агентом, такимкак бентонит и увлажняющий агент, или любым другим носителем, В общем, напитоктакже содерх(ит противовспенивающийагент. Обычно в состав напитка входят приблизительно от 0,01 до 0,5, предпочтительно от 0,01 до 0,1 мас.; активногокомпонента,Когда вещества этого изобретенияпредназначаются для подачи животным ввиде пищи. то эти вещества могут использоваться путем их гомогенного диспергирования в пище, путем подкормки или в видетаблеток. Для того чтобы получить желаемый противогельминтный эффект, активныекомпоненты должны присутствовать, в общем, в виде окончательной концентрации впище от 0,0001 до 0,020 . 5Вещества этого изобретения также могутназначаться парэнтерально для животных путем инъекции в передний отдел желудка,мышцу, трахею или путем подкожной инъекции в виде раствора или дисперсии а жидкомносителе, Для парзнтерального назначенияактивные вещества, предпочтительно, могутбыть смешаны с подходящим растительныммаслом, таким как масло земляного орехаили хлопковое масло. Обычно рецептура такого типа содержит от 0,05 до 50 мас.активного компонента.Вещества, этого изобретения также могут назначаться локально, посредством смешивания их с подходящим носителем, такимкак диметилсульфоксид или. углеводородный рэстворитель, Этот тип рецептуры может вноситс еосредсенно наповерхность тела животного при использовании струи или посредством непосредственной инъекции,Наиболее подходящая пероральная дозировка для получения наилучшего результата зависит от вида животного,подлежащего лечению, и от типа и степениинфекции паразитом. Вообще дозировкасоставляет от 0,01 до 100 мг, предпочтительно от 0,5 до 50,0 мг на 1 кг веса тела животного, Дозировка может быть заданаоднократно или несколько разделеннымидозами в течение относительно короткогопериода, например, от 1 до 5 суток,Настоящее изобретение более подробно иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1, Милбемицин а 11, а 1 з иа 14(соединения В 1, 2 и 3).В каждой из десяти 500-мл колб Эрленмейера инокулироаали до 100 мл предкультуральной среды, содержащей сахарозу.полипептон и К 2 Н Р 04(1%, 0,350 или 0,050 )соответственно с одной колониейЯтгер 1 овусез Ьуцгозсор 1 с 0 з зоЬзр 50аогео 1 осг 1 возоз ЗАИК 60286, После культурирования на вращающемся встряхивателе .а течение 48 часов при 28 С, 1 литр культуральной жидкости трансплантировали в даа30-литровых ферментерах, каждый из которых содержал продуцирующую среду в количестве 20 литров (сахароза 80 , соевыйпорошок 1%, сливки 1 , дрожжевой экс,тракт 0,1%, мясной экстракт 0,1%, карбонатС кальция 0,3, К 2 НРО 40,03, М 9304 7 Н 20 0,1%, ГеЯ 047 Н 200,005 фрН передстерилизэцией 7,2),Культурироаание было осуществлено при 28 С а течение 12 дней в ферментерах при потоке стерильного воздуха 0,5 ччгп при внутреннем давлении 0,5 кг/см, при скорости вращения 40 - 180 об/мин и величине 00-4 - 7 ч/млн. Тридцать два литра культурального материала смешали с 1,8 кг цеолита, и отфильтровали. Мицелиальное отложение промывали 5 литрами воды и фильтрат и промывные воды отбросили, Мицелиальное отложение смешивали с 20 л метанола в течение 1 ч и после фильтрования снова промывали 5 л метанола.Фильтрат и промывные воды отобрали и выпаривали при пониженном давлении с получением около 2 л водной остаточной жидкости. Жидкость экстрагировали три раза 2 л гексана. Слой гексвна промывали три раза 1 л 2%-ного раствора гидроокиси натрия. Слой гексана сушили над водным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат выпаривали с получением 38 грамм масло- образного вещества, Двадцать грамм этого маслообразного вещества растворили в 500 мл гексана. Раствор загрузили в колонку, которая была приготовлена из 300 г силикагеля (МаИ 1 псКгоб 1 1 пс, 5111 сК Туре 60), обработали гексаном и проявили двумя литрами гексана, и затем смесью гексан/этилацетат (3:1).С помощью мониторинга элюироаанных фракций с использованием высокоэффективной жидкостной. хроматографии (НР 1 С) отделили а видесмеси милбемицины а 11. а а, а 1 з, а 14 и а 15. Выпаривание растворителя привело к получению 1,9 г сырого продукта. Продукт полностью растворили в 10 мл смеси 50-ной метанол/вода, Раствор загрузили в колонку, которая была приготовлена из 160 г силанированного силикагеля (Мегс 1 Со., Агт 7719), обработали 50%-ной смесью метанол/вода и проявили 60-ной смесью метанол/вода, затем 70- ной смесью метанол/вода и, наконец, 80- ной смесью метанол/вода. С помощью мониторинга элюированных фракций НР 1 С были получены в виде смеси милбемиЦины С 1 1, Й 12, (Х 13, О 14 и (Х 15 .,Выпаривание растворителя привело к получению 840 мг маслообразного продукта. Весь продукт растворили в 20 мл ацетонитрилэ. Раствор ацетонитрилэ подвергли препаративной НР 1 С с использованием колонки с обращенной фазой (ЯопзЬи Со., 1836426ООЗ, Н, 20 х 250 мм). Каждый раз загружали образцы объемом 1 мл раствора и проявляли смесью 800 ацетонитрил/вода при скорости потока 9,9 мл/мин. С помощью мониторинга фракций с использованием УФ при 240 нм были получены фракции, содержащие продукт. Из каждой такой фракции отогнали растворитель, Лиофилизация остаточной водной жидкости привела к получению 128 мг а 11. 11,7 мг а 1 г,148 мг аз, 43 мг аи и 3 мг а 15 в порядке элюирования, и каждый получился в виде порошкообразного вещества, милбемицин а 11Элементный анализ: С,83, Н = 8,32 Молекулярный вес: 626 (измеренный по масс-спектру электронной бомбардировки. То же, самое применяется и далее), Молекулярная формула, СзгвзН 5 оООУдельное вращение;( а =+ 104,3 (С= 1,05, СНСз).(измеренное с помощью натри- евой О-линии. То же самое применяется далее).УФ-спектр поглощения: Л макс(СНЗОН) нм (Е , см 1): 230 (плечо), 238 (990), 244 (990), 252 (плечо).ИК-спектр поглощения: м макс(КВг) см;3450, 2950, 1715, 1650, 1450, 1380, 1330, 1270, 1220, 1180, 1160, 1140, 1090, 1080, 1050, 1020, 990, 940, 850.Спектр ядерно-магнитного резонанса: (СООз, 270 мГц):1,90 (3 Н, синглет, транс-СНЗ - С(СНЗ)=СНСООС-)2,15 (ЗН, синглет, цис - СНз-С(СНз)=СНСОО-)3,27 (1 Н, дублет квартетов, Сг 5 Н)4,00 (1 Н, дублет, .3 - 6 Гц, С 6 Н)4,65-4,90 (4 Н, мультиплет, Сгбй, Сг 7 Н) Масс-спектр электронной бомбардировки; в/г = 626 (М ), 558, 526, 508, 400, 181, 153. Время удерживания в НР 1 С: 13,4 мин. (СОЯ Н, 6 х 150 мм, Яепэ 1 в, проявляющим растворителем является 80 ацетонитрил/вода, скорость потока 1,5 мл/мин, мониторинг при Уф 240 нм.Такие же условия применяются далее.милбемицин а 1 гЭлементный анализ ф), С = 67,04, Н = 8,01 Молекулярный вес: 628Молекулярная формула: СщНБг 09Удельное вращение; ( а) + 118,30 (С = 1,0, СНОз)УФ-спектр поглощения:А макс(СНзОН) нм (Е, см ): 238(750), 244 (810), 253 (плечо)ИК-спектр поглощения; макс(КВг) см3500, 2950, 1740, 1710, 1450, 1380, 1330, 1290, 1180, 1120, 1090, 1050, 990. Масс-спектр электронной бомбардировки:т/г 628, 556,548, 525,400, 382, 329, 181, 153,Время удерживания НР 1 С: 14,5 мин,милбемицин а 1 з5 Элементный анализ (%): С = 67,41, Н = 8,12Мол. м,:.640Молекулярная формула: Сз 7 Н 5 г 09Удельное вращение: 1 а )23 = + 91,6 (С =0,89, СНСз)10 УФ-спектр поглощения,Лмакс(СНЗОН) нм (Е" 7, см ); 230 (плечо),237 (805), 245 (795), 253 (плечо),ИК-спектр поглощения:смаке(КВг) см: 3500, 2950, 1720, 1650,15 1450, 1380, 1340, 1310, 1270, 1180, 1140,1115, 1095, 1050, 990, 960, 940, 860.Спектр ядерного магнитного резонанса(СОСз, 270 мГц).1,07 (ЗН, триплет, СНзСНг - С(СНз)=СН 20 СОО-)2,16 (3 Н, синглет, СНз-С(СгН 5)=СН - СОО-)3,17 (1 Н, дублет квартетов, Сг 5 Н)4,00(1 Н, дублет,=6 Гц, С 6 Н)4,65 - 4,90 (4 Н; мульти плет, Сг 6 Н, СгтН)25 Масс-спектр электронной бомбардировки:т/г = 640 (М ), 526, 508, 276, 181, 153Время удерживания НР 1 С: 16,4 минмилбемицин а 14Элементный анализ ф): С = 67,62, Н = 7,8430 Мол. м,: 640Молекулярная формула: Сз 7 Н 5 г 09Удельное вращение: ( а) =+ 96,10 (С =1,14, СНСз)УФ-спектр поглощения: Л макс (СНзОН) нм35 (Е, см ): 230 (плечо), 237 (800), 244 (810),253 (плечо)Спектр ядерного магнитного резонанса(СОСз, 270 мГц);3,09 (1 Н, дублет триплетов) = 2,4, 9,3 Гц,40 Сг 5 Н)4,00 (1 Н, дублет, 3 = 6,6 Гц, СбН)4,64-4,88 (4 Н, мультиплет, СгбН, Сг 7 Н)5,81(1 Н. широкий синглет, СзН)ИК-спектр поглощения: м макс(КВг) см:45 3450, 2950, 1720, 1650, 1450, 1380, 1340,1270, 1220, 1180, 1140, 1100, 1060, 1030, 990,960, 860.Масс-спектр электронной бомбардировки:в/г = 640, 540, 522, 276, 263, 195, 16750 Время удерживания НР 1 С: 18,0 мин.милбемицин а 15Мол,м.: 642Молекулярная формула; СзтН 540 аМасс-спектр электронной бомбардировки:55 в/г = 642, 555, 540, 414, 396, 385, 356, 314,264, 245, 195, 167Время удерживания НР 1.С: 19,6 мин.Г 1 р и м е р 2, 5-О-трет-бутилдиметилсилилмилбемицин а 14 (соединение В 13)150 микролитров пиридина и 200 микро- литров 3-метил-бутеноил хлорида добавили к раствору 319,3 мг 26-гидрокси-О-трет-бутилдиметилсилилмилбемицин А 4 в 10 мл метиленхлорида, охлажденного до 0 С, Затем смесь перемешивали в течение ЗО Мин. Реакционную смесь влили в насыщенный водный раствор бикарбоната натрия и экстрагировали метиленхлоридом. Экстракт сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали выпариванием,Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем с получением 326,2 мг целевого соединения (выход 91).Масс-спектр (метод электронной бомбардировки,вй):754(М ), 736, 715, 697, 654, 636, 597, 589 Спектр ядерного магнитного резонанса(270 МГЦ СОС 13, ч/млн):0,11 (ЗН. синглет, Б СНз)0,13(ЗН, синглет, ЯСНз)3,07 (1 Н, дублет триплетов, 3 = 2,4, 9, 3 Гц, СжН)3,85(1 Н, дублет,3 =5,6 Гц, С 6 Н)5,78 (1 Н, синглет, СзН)П р и м е р 3. Милбемицин а 14(соединение йт 3),2,5 мл 68 фтористого водорода в пири- дине добавили к раствору 302,8 мг 5-0-третбутилдиметилсилилмилбемицина а 14 в 15 мл ацетонитрила, охлажденного при 0 С, затем смесь перемешивали в течение 2,5 ч, В: конце этого времени добавили по порядку 300 мг карбоната калия и воду к реакционной смеси и затем смесь экстрагировали хлороформом, Экстракт сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали выпариванием. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем с получением 232,2 мг целевого соединения (выход 900), которое отвечало свойствам милбемицина а 14, полученного в примере 1,П р и м е р 4. 26-(2-бутеноилокси)милбемицин А 4 (соединение М 5). 24 микролитра пиридина и 39 микролитров 2-бутеноимл хлорида добавили в раствору 150 мг 26-гидрокси-0-трет-бутилдиметилсилилмилбемицин А 4 в 2 мл метиленхлорида, охлажденного при 0 С, затем смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Реакционную смесь влили в воду Со льдом и экстрагировали этилацетатом. Экстракт сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали выпариванием, Остаток растворили в 4 мл ацетонитрила, который затем охлаждали при 0 С, 0,5 мл 68-ного фтористого водорода в пиридине добавили к раствору и смесь перемешивали51015 3,08 1 Н, дублет триплетов, 3 = 2,4, 9,3 Гц, С 25 Н)20 4,84(1 Н, дублет,3 =13,3 Гц, СиН) 30 35 40 45 50 55 при комнатной температуре в течение 1,5 ч. В конце этого времени реакционную смесь влили в воду со льдом и экстрагировали этилацетатом, Экстракт промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали выпариванием. Остаток очищали препаративной тонкослойной хроматографией с получением 66,5 мг целевого соединения (48 выход).Масс-спектр (метод электронной бомбардироки, е/г):626(М ),540,522,414,264,245, 191, 167, 151 Спектр ядерного магнитного резонанса (270 мГц, СОС 3, ч/млн.):1,99 (ЗН, дублет дублетов, Л = 6,9, 1,6 Гц, СН СН 3=СН СОО ) 5,87 (1 Н, квартет дублетов, 3 = 1,6, 15,3 Гц,СН-СНЗ=СН-СОО-)7,03 (1 Н, квартет дублетов, 3 - 6,9, 15,3 Гц,СН-СНз=СН-СОО-) П р и м е р 5, 26-(3-Метил-бутеноилокси)милбемицин (соединение В 16)0,15 мл 3-метил-бутеноил хлорида добавили к раствору 177,3 мг 26-гидрокси-0- трет-бутилдиметилсилилмилбемицина и 0,1 мл пиридина в 15 мл метиленхлорида, охлажденного до 0 С. Затем смесь перемешивали в течение 2 ч. Реакционную смесь влили в насыщенный водный раствор бикарбоната натрия и экстрагировали метиленхлоридом, Экстракт сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали выпариванием. Остаток растворили в 10 мл ацетонитрила и затем охладили до 0 С, 1 мл 68 ф-ного фтористого водорода в пиридине добавили к раствору и смесь перемешивали в течение 2 часов. В конце этого времени реакционную смесь влили в насыщенный водный раствор бикарбоната натрия и экстрагировали этилацетатом. Экстракт сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали выпариванием. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем с получением 144,7 мг целевого соединения (выход 867 ь).Масс-спектр (метод электронной бомбардировки, вй).654(М ), 618,554, 428, 410, 356Спектр ядерного магнитного резонанса (270 мГц, СОС 13, ч/млн);3,07 (1 Н, широкий дублет, 3 - 7,7 Гц, С 2 бН) 4,48 (1 Н, широкий дублет, 3 = 4,0 Гц, СбН) 4,68(1 Н, дублет,3-14,7 Гц, С 26 Н) 4,79 (1 Н, дублет, 3 - 14,7 Гц, С 2 бН)