Способ определения молекулярно-массового распределения лектинов и гумусовых соединений почвы

СООЭ СОВГ ТСКИКСОЦИАЛИСТИЧГСКИХРЕСПУБЛИК 5 О.,яц С 12 Р 19/00 БРЕТЕНИ8 У ДВТОРСКО ВИДЕТЕЛ ыхвых ГОсудАРстВенный КОмитетПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ И(56) Орлов Д,С. Применение метода гельхроматографии в почвоведении, мелиорации и сельском хозяйстве. - Методическоеруководство, - Москва-Новочеркасск, 1979,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ Изобретение относится к экспериментальной микробиологии, а именно к способам определения молекулярно-массового(ММР) распределения биологически активных веществ, преимущественно-гумусо вых соединений почвы и бактериальныхлекти нов,Известно определение ММР гумусоввеществ при адсорбции на геле гуминокислот чернозема,Известно также использование методагекьхроматографии для определения молекулярных параметров (молекулярноймассы (ММ), ММР и П) гумусовых соединений почвы (фульво-кислот, гуминовых кислот); к недостаткам следует отнести плохуюсопоставимость результатов по кривымММР и расчитанным по ним с помощьюмаркеров значениям ММ и ММР.Известны способы определения молекулярной массы белков при центрифугировании в градиентах плотности различныхрастворов. Однако они не могут быть использованы в связи с возможностью взаи 2УСОВЫХ СОЕ ИНЕНИ ЛЕКТИНОВ И ГУМ Д И ПОЧВЫ(57) Изобретение относится к экспериментальной микробиологии, а именно к способам молекулярно-массового распределения биологически активных веществ, в частности лектинов и гумусовых соединений почвы, Цель изобретения - упрощение способа, Для этого проводя г ступенчатое градиентное центрифугирование градиента плотности раствора МаС при плотности 1,005 - 1,2 г/см и скорости центрифугирования 25000-35000 об/мин в течение 3 - 5 ч, 10 ил,модеиствия гумусовых веществ или лектинов с компонентами градиентов.Наиболее близким к предлагаемому способу является способ определения молекулярно-массовой неоднородности биологически активных веществ (микробных полисахаридов), включающий градиентное центрифугирование в комбинированном градиенте плотности солей йаС и СзСВЗ, взятых в соотношениях (5:1) - 11;1) (//1/) при постоянном суммарном объеме, причем плотность йаС = 1,03-1,2 г/см и3 СзС = 1,2-1,6 г/см, обеспечиваетдиапазонэпо ММР - 20 " 10 - 210,Недостатком способа является невозможность одновременного определения физико - химических параметров биологически активных веществ.Целью изобретения является упрощение способа.Для этого при разделении биологических активных ве цеста и растворов стандартов ММ (декстринов, полиэтиленгликолей) испольэ;ется градиент плотности растворовСоставитель С,Воцелкоехред М.Моргентал Тираж ПодписноеГосударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва. Ж-З 5, Раущская наб., 475лекулярном распределении данного образца - это его оптимэльнь 1 й режим разделения, Следует заметить, что значителъное увеличение времени или скорости центрифугирования, не дает улучшения получаемых результатов для данного градиента плотности. П р и м е р 3, Показывает возможность использования предлагаемого способа для анализа ММР внеклеточных лектинов в нативном неочищенном состоянии, выделенных иэ культуральной жидкости продуцента В. гпезепсег 1 сцз (зиЬ 1111 з) высаливанием 10(МН 2)504 при 40% и 70% насыщении (препараты соответственно Л 1 и Л 2). 15 При этом центрифугирование проводи ли в режиме, и = 30000 об/мин, 1 = 3 ч, при Ч = 5,5 мл в ступенчатом градиенте ЙаС( р 1 = 1,2 - 0,5 мл,р 2=1,1 - 0,5 мл,р э=1,05-0,5 20 мл, р 4 = 1,03 - 0,5 мл, р 5 = 1,02-0,5 мл, рз =- 1,01 - 0,5 мл и р 7 = 1,005 - 0,5 мл на 45 50 55 Данные кривых МУР препаратов лектинов свидетельствуют о том, что в препарате Л 1 доминирует компонент с ММ 14-15 10 с незначительными примесями компонентов с ММ 60 и 70 10; в препарате ЛИ преобладает компонент с ММ 21-25106, в этом препарате имеется незначительное количество компонентов с ММ 40 10, 70 10 и 110 106,Применение предлагаемого способа позволило показать, что лектины В. пезенегсцз (зиьсйз) представляют собой гликопротеины с различной ММ и небольшой степенью полидисперсности, при этом препаративных ультрацентрифугах:АС=601, Ки БЕКМАН Л. В качествемаркеров использовали декстраны фирмы"Флюка" с ММ 13,5 10, 20 10, 4010 25и 110 10, Учитывая возможности центри 6фуг в одну из пробирок помещали маркеры,а в остальные 2-5-8 - исследуемые образцы. После окончания центрифугированияобразцов или маркеров во фракциях апределяли качественное и количественное содержание углеводов (фенол-сернымметодом). При построении кривых ММР пооси У откладывали интенсивность поглощения при Л = 490 нм, а по оси Х - номер 35фракции. На фиг,4 и 5 приводятся кривые,где а - маркеры, с - образцы. Наличие вобразцах белковой составляющей в молекуле лектинов определяли методом Лаури истроили аналогичные кривые ММР -фиг.4 и 405 в; где по оси У отмечали количественноесодержание по белку, Кривые по ММР оценивались как в качественном аспекте, так ив количественном,в препэоэте Л 1 - содержится больше угле- водных, а в Л 11 - белковых компонентов,П р и м е р 4, Показывает использование предлагаемого способа определения ММР для изучения молекулярных параметров гумусовых соединений почвы. На примере темно-каштановой среднесуглинистой слабосолонцеватой почвы исследовалась динамика распределения углеводных компонентов по фракциям гумусовых соединений, отличающихся своими характеристиками. Исследуемую почву обогащали различными полисахаридами, отличающимися по химическому составу: глюкан - из 81 коЬ 1 оп ароп 1 сит шт. М. 16 (фиг,6). Глюкомэнан из Хапйогпопаз рч, рЬаз 1 о 11(фиг.7 и 8), и определяли обогащенность углеводами различных фракций гумусовых соединений а динамике 1, 2, 3 и 15 сут, Исследуемь 1 е образцы 7 - 9 получали по одной методике, При оценке процессов разложения, деструкции структурирования в данной серии опытов остановились на следующем режиме; п =30000 об/мин, ступенчатый градиент плотности МаС 1 созданный при р 1 = 1,005 - 1,2 г/см, рг = 1,2 - 1 мл, рз = 1,1 - 1,5 мл; р 4 =з1,05-1 мл; р 5 = 1,03-1 мл; р 6 = 1,02-0,5 мл Ч; рб = 1,005 - 0,5 мл /),Наличие маркеров и углеводов ао фракциях исследуемых почв определяли фенолсерным методом, при этом образцы изуцали как окрашенные, так и не окрашенные, результаты совпадали. Это показано на примере образцов почвы, обогащенной бактериальным глюканом из ВгоЬ 1 иа эроп 1 сит шт. М. 16 (см. фиг,6 и табл.2).Пользуясь методическим подходом Орлова расчета ММ, процента по ММ при анализе кривых ММР, получены результать 1 по кривым ММР фиг.6 - 8. Более подробно рассматриваются образцы 7 - 9 - контроль (фиг,6, табл,2; фиг,7, табл.З; фиг,8 табл. 4).Полученные результаты образца й 1 юЬ 1 ца 1 ароп 1 сцпч шт. 16 (табл.2, фиг,6) показывают, что в процессе трансформации микробных полисахаридов, внесенных в почву, на первых этапах (фиг.6) потребление углеводов из низкомолекулярных фракций, при более глубоком разложении, кривая ММР (фиг,6) начинается использование сахаров и средних высокомолекулярных фракций,Анализ кривых фиг.7 и 8 проводили по вышеприведенной схеме,Голученные данные позволили проследить, как в темно-каштановой почве происходят процессы деструкции полисахаридов, фрагментарного обновления гумусовых соединений, которые находят отражение в изПрепарат белок углероды 68000 в ИО 40000 в 0,005 И ЫаС 1 30000 в НО 1,810 4,5 10 6,0 г 2,010 2,410 3,0о Экзополисахаридиз КыоЬЬюд1 ароп 1 сцш шт,16 Глюка н Экзополисахаридиз ХапСЬошопавГцзсапз рч,рЬавИ 1 Глюко- маннан 5,3 О4 2,8"10 1 4 0101 35000 в 0,0 И БаС 1 80000 в П О78000 в 0,01 И аС 114 ООО в Н О Иэннан Ианнан Препарат Л 1 0,03 0,065В.шевепсег 1 сцз(зцЪС 11 з) (3,9:1) 3,5 О 1,2 1021000-24000 в Н О3,0.10 7,51 О 25000 в 0,01 И 1 аС 1 Й р и м е ч а н и е.,Ч - константа седмиментации;оер ФП ,М - константа дифФузии;Концентрированный раствор " 0,01 .И БаС 1, соответствуетплотности 1/2 г/смзменениях: процентном соотношении тех или иных молекулярных массовых компонентов.П р и м е р 5. Показано соответствие результатов, полученных при использовании предлагаемого метода для анализа бактериальных лектинов и метода дискзлектрофореза в ПААГе в присутствии Ма-додецилсульфата,На фиг. 9 и 10 показано распределение белковых компонентов с различной ММ. Так, в препарате Л 1 (фиг,9) преобларает компонент с ММ в пределах 1210 - 1410 (124,1 и 106,6), а в препарате ЛИ фиг,11 -компонент с ММ 23 " 10 - 26 10 (значения 104,5 и 101,3). В обоих препаратах лектинов имеются компоненты и с другой ММ.Формула изобретения 5 Способ определения молекулярно-массового распределения лектинов и гумусовых соединений почвы, предусматривающий фракционное разделение образцов, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения 1 О способа, фракционирование проводят ступенчатым градиентным центрифугированием в растворе йаС плотностью 1,005-1,2 г/см при частоте центрифугирования 25000 - 35000 об/мин в течение 3-5 ч,1756357Таблица 2 Средневесовые молекулярные массы " ИЧ углеводов в различных фракциях гуминовых соединений почвы, обогащенной глюканом иэ РАвоЪап 1 аропдсапшт. 16 (по данным обработки кривых ИМР (фиг. 7) Номер фракций"ст Номер фракции градиента Препарат авДо 13 7 ф 1020 10.40 "1 О70 106ее ва е а аа а а а ва16 очищенный 1 25,3 1, 22,3;44,5,6,77,8,9,10, 11 35280 и 14,1 п 1 44,7 ХЧ 15,3 До 13 71020 1040 ф 107010, р . 4 оаао ва ееееееееееееввааевавеавввеееееееввеаейееваеаее 1,22,3,44,5,66,7,8,9,1010,11,12,1313,14,15 233,4,5,66,7,8 9,10,1111,12, 13 13,7 1020" 1 О40. 1070" 1011010 1 6,8 п 7,8 п 1 10,7 1 Ч 50,015,0 1 17,6 и 7,3 1 П 36,0 ЪЧ 30,6 Ч 8 5 1 2,0п 15,51 п 60,0:дУ 1,52,5ч 3 ю151756357 Т а б л и ц а 3 Средневесовые молекулярные массы - 1 И углеводов в рэзлицных фракцияхгумусовых соединений поцвыь обогаценной глюкоманнаном ХапСЬонопаз Гывсапв рч,рйазо 1 х Препа" Номер фракцийрат градиента Процент фрак" ций 1,2 2,33,4,55,6,7. 45750 9,10 12 49415 Х,1 74205 Хг 2 До 15 м 10 120 101140" 101756357 Таблица Средневесовые молекулярные массы - 15 углеводов в различных Фракциях гумусовых соединений почвы - контроль (полученные по данным обработки кривых В 1 Р Фиг.)Препа- Номер Фракций Мт 4 Фракцийрат гРаЛ,1,2 2 33,4,5,66,7,8,9,10 11,12,3 1,2 2 3 4 г 6,7,8,9