Ингибитор, обладающий противовирусной активностью, и способ его получения

18 909814 4 а б л и ц а 7 1Влияние ннгибитора вирусной активности нацитопатогенное действие и накопление некоторыхРНК- и ДНК-содержащих вирусов Оценка антивирусного действия Инги битор11-субпассаж 1- субпассаж ВВ пп Группы 1 ФЭК (контроль) 800000 Монослой 836000 Монослой 528000 Монослой 2 ФЭК+ингибитор . То же 814000 Монослой 4 б 2000 То же То же 837000 То же 913000 3 ФЭК+ВЭЛ +ингибитор Субнассирование .не проводилосьиз-за деструкциимонослоя первичной культуры 4 ФЭК+ВЭЛ(без ингибитора) посевная доза клеток на 1 мо состояние культурыклеток Цитодесструкц монослоя посевная доза клеток на1 мп состояние культурыклеток посевная доза клеток на1 мл 4,00 3,50 состояние куль-.турыклеток20 909814 19 Таблица 9,Выделение вируса ВЭЛ из клеток фЭК при действииингибитора вирусной активности4Ъ.Используемый материал и способ выделения(вируса Используемые культуры заражение монослояфЭК Монослой первичнойкультурысубпас 11 субпасМонослойсажат Ва ай+ выделен вирус ВЭЛ; - вирус ВЭЛ не выделен Дествие ингибитора, обладающего противовирусной активностью .на накопление вируса ВЭЛ в первые 8 ч послезаражения вирус и ингибитор внесены одновременно). Монослойсажа жизнеспособныеклетки сокультивированиес первично трипсиниэированными ФЭК культуральнаяжидкость22 909814 Включение Нф -уридина в клетки ФЭК: а) контроль (100) фб) ФЭК Ф ангибитор вирусной активности; в) ФЭК + вирус ВЭЛг) ФЭК + вирус ВЭЛ + ингибитор вирусной активности,еской РНК н инфицирован иФических и Влияние панкреатлеточных РНК в ФЭК1 ФЭК+акт.Д.2. ФЭК+акт.Д. +ВЭЛ.3.ФЭК+акт.Д+панкреа4ФЭК5. ФЭК+ВЭЛ.Б. ФЭК+ВЭЛ+панкреати нтеэ вирусс вирусом ВЭЛ ческа еская РНК Влияние и цированный с а) вирус ВЭванный си б). вирус ВЭЛ гибито нтез Р +акт,Д тез РН акт.Д Жра на вирусиндуНК вируса ВЭЛ.вирусиндуциро": "К, принят эа 100),ингибитор.23 909814 24Влияние ингибитора вирусной активности на синтез вирусспецифических и клеточных РНК в ФЭК, инфицированных вирусом ВЭЛ.1. ФЭК+акт.Д2. ФЭК+акт.Д+ВЭЛ3. ФЭК+акт.Д+ВЭЛ+ангибитор вирусной активности.4. ФЭК.5ФЭК+ВЭЛ.б, ФЭК+ВЭЛ+ангибитор вирусной активности. Заказ 6323/1 Тираж 713 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретениЯ и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Изобретение относится к области биологической химии и вирусологии, а именно к получению макромолекулярных биологически активных. веществ, так как известно, что последние могут активно проникать в клетку и 5 оказывать влияние на синтез инфекционных вирусных-частицНаиболее близким к предлагаемому веществу по своим свойствам является интерферон, который подавляет размно О жение разнообразных. вирусов в тканевых культурами, чувствителен к протеолитическим ферментам, термостабилен56 - 80 С ), обладает рибонуклеазной активностью; молекулярная масса, индуцированная вирусами в культу-, .ре ткани или аминотической жидкости находится в пределах 25000-160000 1),Однако интерферон обладает рядом недостатков, которые связаны со сложностью его получения, способ О ностью подавлять репродукцию вируса лишьпри невысокой множественности инфицирования и наличием профилактического, опосредованнбго через клетку действия на вирус. 25Целью изобретения является повы.шение выхода ингибитора и его эффективности, получение ингибитора с высокой вирусингибирующей активностью, обладающего прямым действием как 30 на РНК-, так и на ДНК - содержащие вирусы.Ингибитор, обладающий противови", рисной активностью, имеет элементный, состав,Ъ: 35С 13,38 1 02Н 2,24+ 0,2М 28,90 + 0,2Б, 1,20+ 0,2,Р5,78+ 0,2О Остальное 40 Молекулярный вес 190000 Дальтон.Максимум поглощения в Уф-спектре 274 нм.Прозрачная светло-розовая жид кость, хорошо растворима в воде, ростовых питательных средах, термостабкльна, при лиофилизации - светло-розовый порошок.Блокирует развитие цитодеструк О тивных изменений в инфицированных вирусами клетках и подавляет,на.копление инфекционных вирусных частиц; чувствителен к. трипсину; обладает рибонуклеазной активноотью, сохраняеТ ее после обработки анти- телами к рибонуклеазе, но теряет при этбм,вирусингибирующие свойства; вирусингибирующее действие не .связано с нарушением биосинтетичес- ких кпеточных процессов или синтезом 60 интерферона, подавляет репродукцию как РНК-, так и .ДНК-содержащих вирусов,.сохраняет вирусингибирующие действия после лиофилизации, обладает гемагглютинирующей активностью. 5 Для получе ния ин ги бит ора, облодающего противовирусной активностьюинкубируют вирус с рибонуклеазой,центрифугируют и отделяют конечный;продукт - супернатант, причем ингибитор, обладающий противовируснойактивностью, получают путем совместного инкубирования клеточной вируСсодержащей суспензии, например вируса венесуэльского энцефаломиелиталошадей (ВЭЛ ), и панкреатическойрибонуклеазы при температуре 56-95 Св течение 20-60 мин, после чегоцентрифугируют до образования плотного осадка, выдерживают на холодупри температуре 3-5 С в течение24-72 ч и затем отделяют конечныйпродукт - супернатант, обладающийпротивовирусной активностью и рибонуклеазной активностью,Инкубирование клеточной вируссодержащей суспензии с рибонуклеазойпри температуре 56-95 С в течение,20-60 мин обеспечивает полную инактцвацию инфекционных свойств вирусаи изменение физико-химических свойств.суспензии, в частности появление агрегатов, которые затем центрифугированием переводятся в осадок) выдержитвание на холоде повышает вирусингибирующую активность супернатанта.П р и м е р 1. Для накопления, например, вируса ВЭЛ использовалисьпервично трипсинизированные Фиброобласти эмбриона кур (ФЭК ), которыеготовились по общепринятой методике. Через 48 ч после засева клетоки образования сплошного монослоя производилась смена среды культивирования на поддерживающую, в качествекоторой использована среда 199 сисключением сыворотки, и культураинфицировалась вирусом ВЭЛ из расчета 0,1 ТПД 50 на клетку. Через 24 чпосле появления вирусспецифическойцитодеструкции монослоя культураФЭК шестикратнь эамораживалась иразмораживаюась с целью разрушения клеток. Затем производилось центрифугирование культуры для осаждения разрушенных клеток 3000 об/мин,10 мин )и получался вируссодержащийсупернатаит, который использовалсядля инкубирования с рибонуклеазой.При применении, например, панкреатической рибонуклеазы Ленинградскогозавода мед. препаратов, последняяиспользовалась в концентрации1,750 мкг на 1 мл полученного,супернатанта (один флакон официального препарата. панкреатической рибонуклеазы, содержащий 25 мг фермента,разводился, например, в 14 мл супернатанта вируссодержащей суспензииВЭЛ; исходное значение рН 6,8 ). После этого вируссодержащая суспензияи рибонуклеаза инкубировались,совоместно при 92 С в течение 20 мин,осаждались появившиеся в процессе10 инкубации агрегаты путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин, и суспензия выдерживалась при 4 вС в течение 48 ч. Затем отделялся коыечный продукт - супернатант, который обладал антивирусной актив ностью в объеме 0,2 мл на 1 мп 48-часовой культуры клеток ФЭК и который имел после лиофилизации следующий элементарный состав,Ъ:С 13,380,2Н, 2,24 + 0,2Н . 28,90 + 0,2Б 1,20+ 0,2Р 5,78 + 0,2О Остальное15Молекулярная масса - 190000 Дальтон.Максимум поглощения в УФ-спектре 274 нм. Полученный ингибитор обладал рибонуклеаэной активностью (см. табл. 1 ), а также гемагглютинирую щей активностью (см. табл. 2 ).Иакромолекулярная природа ингибитора иллюстрируется, помимо молекулярной массы и максимума поглощения в УФ-спектре, характерного для 25 белка (,274 нм), следующими данными. Полученный продукт был чувствителен к трипсину, который инактивировал его активирусное действие (см. табл. 3 ). Инактивация антивирусного действия наблюдалась и в случае действия на ингибитор антисыворотки против рибонуклеазы (см. табл.4 ). Макромолекулярная природа ингибитора подтверждалась также и высоким содержанием И и Р, что не исключает присутствия в нем олигонуклеотидов вирусного и клеточного происхожде-. ния.П р и .м е р 2. Вируссодержащий супернатант, полученный, как указано в примере 1, инкубировался с рибонулеаэой при 95 С в течение 60 мин и после осаждения образовавшихся агрегатов выдерживался при 5 С в течение 72 ч. Затем, как в примере 1, 45 отделялся конечный продукт - супер, натант, обладающий тЕми же свойствами, что и в примере 1, но меньшей антивирусной активностью по сравнению с примером 1. 50П р и м е р 3. Вируссодержащий супернатант, полученный, как указано в примере 1, инкубировался с рибонуклеазой при 56 С в течение 20 мин и после осаждения образовавшихся агрегатов выдерживался при 3 С в течение 24 ч. Затем, как и в примере 1, отделялся конечный продукт,супернатант, который обладал теми 1 же свойствами, что в примерах 1 и 2, но меньшей антивирусной активностью. 60С целью изучения вирусингибирующего действия макромолекулярного ингибитора, полученного по предложенному способу, исследовалось влияние супернатантов из неинфицированных 5 клеток, приготовленных с использованием рибонуклеазы по предлагаемому способу, на действие термической обработанной и необработанной (нативной ) рибонуклеаз в дозе 350 мкг и 1000 мкг на 1 мл инфицируемой вирусом ВЭЛ культуры ФЗК (т.е. в тех же дозах в пересчете на 1 мя, в каких рибонуклеаэа могла присутствовать в макромолекулярном ингибиторе, будучи добавленной при его получении, и трехкратно больших ), а также действие вирусосодержащих суспензий, полученных по предлагаемому способу, но беэ инкубации с рибонуклеазой. Кроме того, действие макромолекулярного ингибитора вирусной активности сравнивалось с интерфероном, полученным иэ клеток ФЭК при помощи вируса болезни Ньюкасла, так как примеси интерферона могли быть в препарате, получаемомиз инфицированных вирусом клеток, и который заведомо в больших количествах,как и все исследуемые ингредиенты, вносился одновременно с инфицированием культуры вирусом ВЭЛ.Как видно из данных, представленных в табл. 5, внрусингибирующее действие, проявляющееся как в защите монослоя ( блокирование цитопатогенного действия вируса ), так и подавлении репликации вируса, оказывают только макромолекулярные ингибиторы, полученные по предлагаемому способу, причем антивирусное действие не было связано с их прямой рибонуклеазной активностью.Защитное действие макромолекулярного ингибитора вирусной активности, проявляющееся в блокировании цито- деструктивных изменений в монослое, вызываемых вирусом ВЭЛ, и подавлении его накопления в культуре клеток ФЭК, не связано с синтезом интерферона, так как последний в культуре клеток ФЭК отсутствовал (см: табл. б ).Гидролитическое действие макро- молекулярного ингибитора в отношении РНК не снималось актисывороткой, хотя, как указывалось выше, сыворотка против рибонуклеазы блокировала его антивирусное действие.Ингибитор, полученный по способу, описанному в примере 1 ( с вирусом ВЭЛ ), обладал антивирусной актив" алостью и в отношении. других РНК- и ДНК-содержащих вирусов. Дествие ингибитора в отношении вирусов с Фрагментированным геномом наблюдалось лишь при трехкратном увеличении до" зы по сравнению с вирусами с нефрагментированным геномом (см. табл. 7 ), Ингибитор проявляет антивирусное действие при добавлении лишь в течение 0,5 ч после заражения монослоя, действуя на этапы репликативного цикла вируса ( Фиг. 1 ).Н а фи г. 2 представлены данные о влиянии макромолекулярного ингибитора на синтетические процессы внормальных и инфицированных вирусомВЭЛ клетках ФЭК, оцениваемые повключению Н -урндина: ингибитор9вирусной активности. не снижает синтеза РНК в нормальной клетках ЗЭК 5(фиг. 2, б ) и вызывает полную нормализацию синтеза в клетках ФЭК, инфицированных вирусов ВЭЛ (фиг. 2,г ),На фиг. 3 показано подавление вирус-индуцированных синтезов ( б 1 при действии ингибитора на фоне актиномицина Д.В табл. 1 представлены данные обизучении гидролитической (рибонук-.леаэной активности ингибитора вирусной активности, полученного позаявленному способу, в отношениидрожжевой РНК в сравнении с таковойпанкреатической рибонуклеазы, которая использовалась в процессе полу- .чения ингибитора вирусной активностиИз данных, представленных втабл. 1, следует,.что ингибиторвирусной активности осуществляетгидролиэ дрожжевой РНК в равной мерес используемой для его получения рибонуклеазой, которая не подвергаласьтермическим воздействиям. Последнееобстоятельство находится в соответствии с литературными данными о термостабильностн рибонуклеазы.и, казались, может свидетельствовать впользу того, что антивирусное действие ингибитора связано с сохраняющейся в нем рибонуклеаэной активностью, Однако используемая нами 35в контрольных Опытах рибонуклеаза,применяемая также в концентрации350 мкг на 1 мп инфицированной культуры, не оказывала никакого антивирусного действия (.см. табл. 4,группы 4"10. Задержка развития цитопатического действия вирусов былаполучена при использовании рибонуклеазы в концентрации 1000 мкг/мп(см. табл. 5, 9 п.п 11.Таким образом, предложенный йнгибитор вирусной активности представляет собой новую макромолекуляриую структуру.Антивирусное действие ингибитора не связано с синтезом интерферо" 50на, подавлением метаболизма клеток или с непосредственным гидроло- .гическим действием нуклеазы на вирусную нуклеиновую кислоту. Антивирусные свойства ингибитора находятся,как видно, в зависимости от присутствия в нем субстанций белковой природц, являющихся составными частямизараженных клеток и рибонуклеазы,объединенных в макромолекулярныйкомплекс. Присутствие в .ингибиторе 60относительно большого количества азота и фоСфора не исключает наличия внем олигонуклеотидов вирусного иклеточного происхождения. Заявляемый макромолекулярный ингибитор ви- у русной активности действует как наРНК-, так и ДНК-содержащие вирусы;нетоксичен и не снижает синтез клеточных макромолекул, прост в получении, вызывает защиту клеточногомонослоя от цитопатическогл действиявирусов и подавление репродукциивирусов; вызывает полную нормализацию синтеза РНК вирусинфицированныхклеток; чувствителен к трипсину,обладает рибонуклеазнойактивностью,термостабилен (95 С, 60 мин ),П р и м е р 4. Вышеуказанные свойства вещества найдут широкое применение в вирусологических исследованиях,Моделирование хронической ин"фекции и персистирование вирусныхагентов в культуре ткани.В качестве приьефра приводимданные о персистировании вирусаВЭЛ в культуре ФЭК, полученные прииспользовании ингибитора вируснойактивности. 48-часовую культуру ФЭКинфицировали вирусом ВЭЛ (0,.0001 ТЦДна клетку ) без макромолекулярногоингибитора вирусной активности и вприсутствии последнего, которыйвносили в объеме 0,2 мл на 1 млкультуральной среды. Имелись соответствующие беэвнрусные контроли,где культивирование ФЭК проводили в присутствии одной культуральнойсреды и культуральной среды е ингибитором вирусной активности, Первыйсубпассаж в группах 1-3 (,см. табл.8)проводили после развития цитодеструк.тивных изменений в группе 4, гдеинфицирование клеток осуществлялибез добавления макромолекулярного ин-.гибитора вирусной активности; последующие субпассажи проводили после образования монослоя в группах1-3, В субпассажах повторное добаВление ингибитора проводили на следующие. сутки после пересева культуры в объеме 0,04 мл на 1 мп культуральной среды. Вирусологические исследования проводили путем сокультивирования субпассируеьых клеток спервично трипсинизированными клетками ФЭК; кроме того, на наличие вируса исследовали бесклеточную культуральную жидкость иэ перевиваемыхтканевых культур, инфицированныхвирусом ВЭЛ при добавлении ингибитора вирусной активности (данныевирусологических исследований отражены в табл. 9 .Как видно иэ данных, представлен-,ных в табл, 8, вирус ВЭЛ, вносимыйбез макромолекулярного ингибиторавирусной активности, вызывает развитие цитопатических изменений идеструкцию клеточного монослоя первичной культуры ФЭК, исключая тем садым возможность последующего культивирования клеток. Добавление ингибитора вирусной активности полностью блокирует развитие цитодеструктивных изменений в первичной культуре, что позволяет осуществить дальнейшее субпассирование первично трипсинизированных клеток ФЭК. Блокирование цитодеструктивных изме нений в этой группе подтверждается и данными по концентрации клеток на 1 мл снятого трипсином монослоя ( поскольку клетки пересевались в отношении 1:1, то посевная доза, указанная в субпассажах, отражает урожай клеток предшествующего моно- слоя ). Видно, что количество клеток при снятии монослоя первичной культуры ФЭК в Группе 3 (ВЭЛ +ингибитор вирусной активности ) практически такое же, как и в основной контроль-. ной группе, где не проводилось инцифирование вирусом ВЭЛ и не добавлялся макромолекулярный ингибитор 1 соответственно 837000 и 83600020 клеток/мл ).Образование моиослоя происходило йф при последующем субпассировании культуры, несмотря на персистирование вируса ВЭЛ.в клетках ФЭК что 25 подтверждается данными вирусологических исследований 1,см. табл. 9 ).ПредставленныЕ в табл. 9 результуты указывают на то, что имеет место персистирование вируса ВЭЛ в клет-З 0 ках ФЭК, так как иэ культуральной жидкости вирус выделен не был.Таким образом, результаты представленные в табл. 8 и 9, указывают на наличие персистентной инфекции в клетках ФЭК и свидетельствуют о возможности использования ингибитора вирусной активности для изу - . чения молекулярно-биологических механизмов хронических вирусных инфекций.40Характеристйка РНК-полимеразных реакций вирусных агентов.Исследования проведены с вирусом гриппа А (РРЧ) НоэТос/34. Установлено, что макромолекулярный инги битор вирусной активности, внесенный в культуру ФЭК сразу после зара" жения ее вирусом, при последующем анализе (1 пу 1 го) полимеразной активности микросомальной Фракции вирусинфицированных клеток проявил 95-ное ингибирование синтеза вирус. - специфической РНК по сравнению с контролем. Кроме. того, ингибитор ак.тивно утилизируется клетками, так как внесение его в культуру за 30 мин до заражения вирусом практически не влияло на полимеразную активность микросомальной фракции вирусинфици, рованных клеток.Указанные свойства ингибитора ви русной активности позволяют наметить пути и способы блокирования РНК-полимеразных реакций вирусных агентов при,помощи биологически активных клеточных метаболитов. , 65 Избирательное подавление синтеза вирусной РНК 1 ингибитор вирусной активности как модулятор нуклеолнтической активности, направляющий действие Фермента на блокирование синтеза вирусных, но не клеточ" ных РНК ).Ниже представлены данные, свидетельствующие о возможности использования ингибитора вирусной активности для избирательного подавления синтеза вирусных РНК.Нуклеолитическая активность ингибитора вирусной активности и панкреатической рибонуклеазы, используемой для его получения, является одинаковой ( см. табл, 1 ). В этой связи исследованы особенности действия Фермента ( панкреатической рибонуклеазы )и ингибитора на синтез вирусспецифических и клеточных РНК в клетках ФЭК 1 инфицированных вирусом ВЭЛ, Вирусспецифические синтезы изучались на Фоне актиномицина Д; клеточные - без использования укаэанного антибиотика. Результаты исследований представлены на Фиг. 4 и 5.Панкреатическая рибонуклеаэафиг. 1, группа 3) резко подавляет Р (0,001) синтез вирусспецифической РНК вируса ВЭЛ. Однако это не сопровождается восстановлением синтеза РНК инфицированных клеток - в присутствии вируса ВЭЛ и панкреатической рибонуклеазы он достоверно ниже, чем при инфицировании клеток только вирусом ВЭЛ ( фиг. 4, соответственно группы б и 5 ),Совершенно другие закономерности в отношении синтеза клеточной РНК в вирусинфицированных клетках были установлены при действии ингибитора вирусной активности, который, как указывалось выше, по нуклеолитической активности не отличался от панкреатической рибонуклеазы. Как видно из данных, представленных на фиг. 5, группа б, добавление ингибитора вирусной активности при инфицировании клеток вирусом ВЭЛ приводит к сохранению синтеза клеточной РНК на уровне неинфицированного контроля (фиг. 5, группа 4 - не- инфицированный контроль). При этом следует заметить, что синтез вирусоспецифической РНК вируса ВЭЛ ингибитор вирусной активности угнетает также, как панкреатическая рибонуклеаза (фиг. 5. группа 3). Таким образом, представленные данные свидетельствуют о способности ингибитора вирусной активности избирательно подавлять синтез гетерогенных для клетки нуклеиновых кислот, что указывает на возможность создания биологически активных веществ, контролирующих клеточную индивидуальность на генном уровне.10 9 909814Изучение начальных этапов репродукции вирусных агентов. эуемый ингибитор снизил содержаниемеченых вирусных структур в цитоплазматической фракции клеток на 76и в ядерной на 69. Полученныеданные позволяют заключить, что 5 ядерная и цитоплазматическая фазырепродукции вируса гриппа обладаютодинаковой чувствительностью к вирусингибирующим веществам макромолекулярной природы. Т а б л и ц а 1гСравнительная характеристика гидролитической активности ингибитора и панкреатической рибонуклеазы по отношению к дрожжевой РНК Разведения ингредиентов, обЪеми количествоРНК-аэы, используемой для гидро лиза РНК Исследуемые ингредиенты Панкреатическая рибонуклеаэа 1 750 мкг/мл 1 молекулярная масса 12000 ) 10000 раз0,25 мп43 нг 850 Ингибитор вируснойактивности (1 мп.молекулярная масса 190000 ) 10000 раз 0,25 мп 43 ига 845 П р и м е ч а н и е ф - указано ожидаемое количество РНК-азы,исходя иэ расчета добавляемОго количествафермента при изготовлении ингибитора вирусной активности. Табл и ц а 2Характеристика гемагглютинирующей активности ингибитораи составляющих его компонентовРазведения исследуеьнх ингредиентов и учет гемагглютинации аВ ггт г+ПанкреатическаяРНК-аэа Вируссодержащая суспензия ВЭЛ Все исследуемые ингредиенты инкубировались при 92 ОС 30 мин Клетки ФЭК заражали вирусом гриппа А (РРУ) йоэйос/34 и через 30 мин обрабатывали ингибитором вирусной активности. В результате последующего фракционирования клеток, проведенного через 60 мин после заражения, установлено, что исполь. Количество распав"шейся РНК (на 1000 мкг)после инкубации с исследуемыми ингредиентами, мкг12 909814 Таблица 3 Влияние трипсина на вирусингибирующне свойства ингибитораОценка активного действия Исследуемые ингредиенты цитопатогенное действие вируса ВЭЛ подавление накопления вируса ВЭЛв 78 ТЦД 7,50 Ингибитор Ингибитор +трипсин 0П р и м е ч а н и ег исследование проведено с вирусом ВЭЛ,трипсин использовался в концентрации 250 мкг/мл,не бкаэывающей токсического действия на культуру,клеток ФЭК. Т а б л и ц а 4Влияние антисыворотки к панкреатической рибонуклеаэе навирусингибирующую и ферментативную активностьюингибиторам Оценка антивирусного действия Исследуеваюе ингредиенты цитопатогенное действиевируса ВЭЛ 845 7,50 Ингибитор Ингибитор + антисыворотка противРНК-азы 890 О Ингибитор + нормальная сыворотка 850 7,50 П р и м е ч а н и е: 1 разведения исследуезаас ингредиентов и ихобъем, используемай для гидролиэа с РНК,так и в таблице 1; подавлениенакоплениявируса ВЭЛв Ц ТЦд О) КоличествораспавшейсяРНК 1 иэ 1000 мкг)после инкубациис исследуемымиингредиентами,мкг(группы 4-15 ) 1Таблица 5Вирусингибнруюшее действие ингибиторов, полученныхкак описано в примерах 1-3 Ингибитор, полученныйиз инфицированных клетокпо примеру 1 (РНК-аза,92 С, 30 мин) 1Ингибитор полученныйиз инфицированных клетокпо примеру 2 (РНК-аза,.95 оС, 60 мин )Ингибитс)р, полученный иэ инфицированных клеток по примеру 3 ( РНК-аза,56 С, 20 мин ) Супернатант полученныйиз неинфицированных клеток по методике, используемой в примере 1(РНК-аза, 92 С, 30 мин) Супернатант, получениыйиз неинфицированныхклеток по методике, используемой в примере 2(РНК-аза, 95 С, 60 мин) Супернатант, полученныйиз неинфицированныхклеток по методике,используемой в примере 3 (РНК-аза,56 С, 20 мин)16 909814 15 Продолжение табл. 5 Группы Исследуемые ингредиенты Оценка антивирусного действияподавление накопления вируса ВЭЛ в 18 ТЦДд. цитопатогенное действиевируса ВЭЛ Вируссодержащая суспензияо инкубированнаяпрй 92 С 30 мин(без РНК-азы) 12. О Вируссодержащая суспензияб ннкубируемаяпри 96 С 60 минбез РНК-азы ) 13. 0Вируссодержащая суспензия инкубируемаяпри 56 С 20 минЛ без, РНК-азы Интерферон 16 ед/мя 15. 0 16. МТитр вируса ВЭЛ вклетках ФЭК со средой 199"8,5 Хд ТПДО Таблицаб Определение интерферона в клетках ФЭХ послевнесения ингибитора вирусной активности ивируса болезни Нъвклела (ВБН )" Время определения и титр интерферона, ед/мл Исследуемые ин гредиенты 48 24 16 ВБН Ингибиторвируснойактивности 0 0 0 П р и м е ч а н и е: исследуемые ингредиенты вносились в 48-часовувкультуру ткани ФЭК одновременно с инфицированным вирусом ВЭЛ в дозе 10000 ТЦД 00.,Ингредиенты 1-14 вносились в объеме 0,2 мпна 1,мл тканевой культуры ФЭК, в 9 пп 15 вместосреды 199 внесен интерферон в объеме 1,2 мл,Учет цитопатогенного действия (+ миним.,максимальное, - отсутствие ) и накоплениевируса оценивалось через 48 ч после инфицирования. Подавление накопления вируса ВЭЛ оценивалосьпо разности титров в группах 1-15 с титром вирусав группе 16 1 ФЭК+ВЭЛ+среда 199 ).