Способ получения рибоксина

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОКСИНА, предусматривающий приготовление посевного материала - продуцента Bacillus subtilis на агаризованной среде, культивирование продуцента в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, ростовые факторы и минеральные соли, с последующим отделением полученной биомассы и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода рибоксина, в качестве продуцента используют штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-48.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при приготовлении посевного материала-продуцента используют агаризованную среду, содержащую кукурузный экстракт и гидролизат БВК.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование продуцента ведут на среде следующего состава, % : техническая глюкоза 12 - 15; азотнокислый аммоний 1 - 3; БВК 2,5 - 3,0; кукурузный экстракт 0,5; мел 2,0; хлористый или сернокислый магний 0,3 - 0,5; вода - остальное.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в процессе культивирования аэрацию среды ведут так, что скорость растворения кислорода составляет 2,4 - 3,8 г О₂/л ч.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при культивировании содержание аммонийного азота в среде составляет 0,1 - 0,2% .
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование продуцента ведут при pH, равном 6,4 - 6,6.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в процессе культивирования содержание углекислого газа в пределах 0,7 - 0,9% регулируют путем подачи воздуха в количестве 0,5 - 2,5 об/об мин.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам для получения рибоксина (инозина), используемого в медицине при терапевтическом лечении ряда болезней сердца, печени и при нарушениях клеточного метаболизма, таких как лейкопении и др. Он может быть использован в качестве сырья для получения антиметаболитов - противоопухолевых препаратов. Кроме того, рибоксин является исходным соединением при химическом и микробиологическом получении инозиновой кислоты.
Известен способ получения рибоксина микробиологическим синтезом, согласно которому в качестве продуцента используют штамм Bacillus subtilis Ген = 265, не продуцирующий аденин, тирозин, гистидин. Максимальный выход инозина по этому способу составляет 7-10 г/л.
Известен также способ получения инозина путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов вида Bacillus subtilis на питательной среде, содержащей чистые аминокислоты (метионин, лизин, глутаминовая кислота), витамины (В₁, В₂, В₁₂), рибонуклеиновые кислоты, гидролизат соевого белка. Выход инозина в оптимальных условиях ферментации составляет в данном случае 17,2 г/л.
Наиболее близким техническим решением к заявленному по достигаемому эффекту является способ получения рибоксина, предусматривающий приготовление посевного материала - продуцента Bacillus subtilis на агаризованной среде, культивирование его на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, ростовые факторы и минеральные соли, в условиях аэрации среды с последующим отделением полученной биомассы и выделением целевого продукта. В качестве продуцента используют штамм Bacillus subtilis ЦМПМ-1321. Ферментацию ведут на средах, содержащих недефицитное сырье, а именно: техническую глюкозу, сахар, гидрол, БВК, кукурузный экстракт соли аммония, магния и кальция. Получают в культуральной жидкости 10-12 г/л инозина за 65-120 ч ферментации.
Целью изобретения является разработка нового более эффективного способа получения рибоксина (инозина), обеспечивающего более высокий выход продукта на стадии ферментации в полупромышленных и промышленных условиях.
Поставленная цель достигается тем, что в качестве продуцента используют штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-48.
Для повышения выхода рибоксина целесообразно использовать агаризованные среды, содержащие кукурузный экстракт и гидролизат БВК, культивирование продуцента вести на среде, содержащей, % : техническая глюкоза 12-15; азотнокислый аммоний 1-3; БВК 2,5-3,0; кукурузный экстракт 0,5; мел 2,0; хлористый или сернокислый магний 0,3-0,5 и вода. При этом в процессе культивирования аэрацию ведут так, что скорость растворения кислорода составляет 2,4-3,8 г О₂/л ч, содержание аммонийного азота поддерживают в среде в пределах 0,1-0,2% , а культивирование продуцента осуществляют при рН, равном 6,4-6,6. Содержание углекислого газа в процессе культивирования в пределах 0,7-0,9% регулируют путем подачи воздуха в количестве 0,7-2,5 об/об мин.
Высокопродуктивный мутантный штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-48 получен из штамма Bacillus subtilis ЦМПМ В-1321 в результате применения генетико-селекционных методов работы, в частности приобретения резистентности к 6-тиогуанину.
Штамм ВНИИгенетика-48 обладает более высоким уровнем накопления инозина. Выращивание посевного материала на штамме ВНИИгенетика-48 осуществляют как на агаризованной среде Хоттингера, так и на агаризованных средах, содержащих дешевое, легкодоступное сырье - кукурузный экстракт и гидролизат БВК.
Штамм ВНИИгенетика-48 хранится в музее культур промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика, имеет регистрационный номер ЦМПМ В-1796.
Способ осуществляют следующим образом. В качестве продуцента используют мутантный штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-48. Культуру штамма, выращенную на агаризованной среде Хоттингера или на дешевых агаризованных средах, содержащих кукурузный экстракт и БВК, в течение 20-24 ч при 37^oС, переносят в колбы с посевной средой и выращивают при постоянном перемешивании и аэрации в течении 20-24 ч при температуре 28^оС. Затем посевной материал, выращенный описанным способом, или суспензию клеток, смытых физраствором с поверхности агаризованной среды, переносят в ферментационную среду в количестве 0,05-2 об % . Процесс биосинтеза осуществляют в колбах на качалке (240-270 об/мин) и в ферментерах (объем 1 м³) при аэрации и перемешивании, соответствующих скорости растворения кислорода 2,4-3,8 г О₂/л ч. Оптимальная температура процесса ферментации 30-34^оС. Посевные и ферментационные среды содержат в качестве источника углерода техническую глюкозу, источника азота - азотнокислый аммоний, источника ростовых факторов - БВК, кукурузный экстракт, пептон, минеральные соли (MgCl₂ или MgSO₄, NaCl), мел. Все компоненты питательных сред смешивают и стерилизуют.
В полупроизводственных и производственных условиях регуляцию процесса биосинтеза осуществляют путем стабилизации рН на уровне 6,4-6,6 с помощью 25% -ного раствора аммиака, поддержания уровня аммонийного азота в пределах 0,1-0,2% периодическим добавлением 20% -ного водного раствора азотнокислотного аммония и регулирования содержания СО₂ на выхлопе в пределах 0,7-0,9% изменением скорости подачи воздуха в аппарат в пределах 0,7-0,9% изменением скорости подачи воздуха в аппарат в пределах 0,7-2,5 об/об мин для обеспечения достаточной вентиляции с целью снятия ингибирующего действия СО₂.
Способ обеспечивает выход рибоксина (инозина) до 30-40 г/л за 85-120 ч ферментации.
П р и м е р 1. Культуру штамма Bacillus subtilis ВНИИгенетика-48, выращенную в течение 24 ч при 37^оС на агаризованной среде Хоттингера, переносят на жидкую посевную среду следующего состава, % : Глюкоза техническая 2,0 Пептон 1,0 БВК 1,0 NaCl 0,25
Посевной материал выращивают в колбах емкостью 750 мл, содержащих 100 мл, среды на качалке, делающей 220-250 об/мин в течение 20-24 ч при 28^оС. Инокулят передают в ферментационную среду в количестве 2 об. % .
Состав ферментационной среды, % : Глюкоза техническая 12,0 БВК 2,5 NH₄NO₃ 2,5 MgCl₂ 0,5 Мел 2,0 рН 7,0
Процесс ферментации проводят методом глубинного культивирования в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащих 20 мл среды, скорости растворения кислорода 3,6 г О₂/л ч и температуре 30 1^оС, на качалке, делающей 240-270 об/мин. Выход рибоксина после 120 ч ферментации составляет 30 г/л. Выделение рибоксина осуществляют известными способами.
П р и м е р 2. Культура и условия ферментации те же, что в примере 1. Отличие состоит в составе питательной агаризованной среды для поддержания культуры и в подготовке посевного материала. Культуру выращивают в течение 20-24 ч при 37^оС на агаризованных питательных средах следующего состава, % : Глюкоза техническая 1,0 Гидролизат БВК 5,0 Пептон 1,0 NaCl 0,5
или глюкоза техни- ческая 2,0 пептон 1,0 кукурузный экстракт 2,5 NaCl 0,5
Выросшую культуру смывают с поверхности агаризованной средой физиологическим раствором и засевают ею ферментационную среду в объеме 1-2 об % . Выход рибоксина после 140-160 ч ферментации составляет 30 г/л.
П р и м е р 3. Культура и условия ферментации те же, что в примере 1. Отличие состоит в составе ферментационной среды и температурном режиме. Ферментацию осуществляют при температуре 34^оС на ферментационной среде следующего состава, % : Глюкоза техническая 14,0 БВК 3,0 NH₄NO₃ 3,0 Мел 2,0 MgCl₂ 0,5 pH 7,0
Выход рибоксина после 120 ч ферментации составляет 40 г/л.
П р и м е р 4. Культуру выращивают на агаризованной среде, как указано в примере 2, активируют на качалке при температуре 28-30^оС в течение 2-3 ч и засевают ферментационную среду суспензией клеток в количестве 0,05 об. % . Состав ферментационной среды, % : Глюкоза техническая 14-15 БВК 2,5 Кукурузный экстракт 0,5 NH₄NO₃ 1-2 Мел 2,0 MgSO₄ 0,3 рН 6,8-7,0
Процесс ферментации проводят в аппарате емкостью 1 м³. Аппарат снабжен турбинной мешалкой, дающей 240 об/мин, барботером и системой автоматического пеногашения. В процессе ферментации контролируют потребление глюкозы, аммонийного азота, изменение рН, а также уровень СО₂.
Для поддержания рН на уровне 6,4-6,6 периодически добавляют 25% -ный раствор аммиака; для поддержания концентрации аммонийного азота в среде в пределах 0,1-0,2% периодически добавляют 20% -ный водный раствор азотнокислого аммония; для поддержания содержания СО₂ на выхлопе в пределах 0,7-0,9% регулируют подачу воздуха в аппарат от 0,7 до 2,5 об/об мин.
Выход рибоксина после 85 ч ферментации составляет 32 г/л. Выделение рибоксина осуществляют известными способами.
Максимальный выход рибоксина (инозина) на штамме ВНИИгенетика-48 составляет 30-40 г/л за 85-120 ч ферментации на оптимизированных питательных средах, содержащих недефицитное сырье, при повышенной температуре и достаточной аэрации. Высокая эффективность предлагаемого способа на основе нового штамма в полупроизводственных и производственных условиях достигается регулированием процесса биосинтеза рибоксина путем поддержания рН на оптимальном уровне раствором аммиака, концентрации аммонийного азота в среде в определенных пределах и обеспечения достаточного перемешивания и аэрации с целью снятия ингибирующего действия СО₂.
(56) Авторское свидетельство СССР N 382676, кл. С 12 D 13/06, 1971.
Патент США N 3960661, кл. 195-28, 1976.
Авторское свидетельство СССР N 594769, кл. С 12 D 13/06, 1976.