Способ определения родства живых организмов

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОДСТВА ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ, включающий выделение ДНК, обработку рестрикционными эндонуклеазами, электрофоретическое фракционирование фрагментов ДНК, перенос ДНК из геля на нитроцеллюлозные фильтры, гибридизацию ДНК из живого организма с высокомеченными одноцепочечными пробами в присутствии буферной системы с последующей отмывкой гибридизационных фильтров, экспонирование их на рентгеновской пленке и анализ полученных картин гибридизации, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и распространения на разные таксономические группы организмов, ДНК из живого организма гибридизируют непосредственно с меченой ³²P пробой на основе ДНК фага М13 с удельной активность 10⁹ имп/мин/мг в присутствии буферной системы, состоящей из 6 SSС, 5 ммоль ЭДТА, 10-кратного раствора Денхардта, 0,1% SDS, 40% формамида в течение 16 - 20 ч при 42^oС, а отмывку проводят при 65^oС в растворе, содержащем 1 SSС и 0,1% SDS.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к генетической инженерии широкого круга живых объектов. Изобретение может быть использовано в криминалистике (идентификация личности, установление отцовства и материнства), в генетике и селекции сельскохозяйственных животных и растений для классификации сортов и пород, характеристики инбредных линий, в практической микробиологии для идентификации штаммов микроорганизмов.
Целью изобретения является упрощение способа и распространения на разные таксономические группы.
Способ заключается в том, что осуществляют блот-гибридизацию рестриктированной ДНК из живых организмов с меченной по фосфору ДНК фага М13.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
П р и м е р 1.
Замороженные в жидком азоте образцы тканей растирают в ступке и гомогенизируют в гомогенизаторе при 0^оС в буфере, содержащем 40 мМ Трис-HCl рН 8,0; 5 мМ ЭДТА; 1хSSC. К полученной суспензии добавляют SDS до 0,5% , протеиназу К до концентрации 100 мкг/мл и инкубируют при 42^оС в течение ночи. Далее к лизату добавляют NaCl до 1 М и проводят 3-кратную депротеинизацию (фенол, смесь фенол : хлороформ 1: 1), хлороформ). ДНК осаждают этанолом , осадок промывают 70% -ным спиртом и растворяют в стерильной дистиллированной воде.
Выделение ДНК из крови и ДНК индивидуальных мух D. melenogaster проводят известными методами.
ДНК обрабатывают рестриктами в стандартных условиях при 37^оС в течение 3 ч. Электрофорез проводят в горизонтальном блоке 1% -ного агарозного геля при напряженности поля 0,8 В/см.
ДНК, фракционированную в агарозном геле, переносили на нитроцеллюлозные фильтры по методу Саузерна. Гибридизацию проводят с высокомеченными одноцепочечными пробами на основе ДНК фага М13 в отсутствие конкурента ДНК лосося. Гибридизационный раствор содержит 6 SSC, 5 мМ ЭДТА, 40% формамида 0,1% SDS, 10-кратный раствор Ленхардта, 1-2 х 10⁷ имп/мин (³²Р) ДНК пробы: продолжительность инкубации составляет 16-20 ч при 42^оС. После гибридизации фильтры отмывают при 65^оС в растворе, содержащем 1хSSC, 0,1% SDS и экспонируют с рентгеновской пленкой.
Высокомеченные пробы на основе ДНК фагового вектора М13 получают несколькими способами: 1) с использованием гибридизационного праймера для ДНК М13 и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1; 2) с использованием праймера для секвенирования в ДНК М13 и 3) с использованием рассеянной затравки. Удельная активность проб составляет 10^oимп/мин/мкг.
П р и м е р 2. ДНК обрабатывают двумя рестриктазами BspR1+Alu1. Получают картины гибридизации для отца и матери. Они сильно различаются, как это и должно быть для двух неродственных индивидуумов. У братьев число совпадающих гипервариабельных фрагментов значительно больше. Те или иные варианты гипервариабельных участков наследуются детьми от своих родителей, причем наследование носит не цитоплазматический, а ядерный характер. т. к. вариабельные фрагменты наследуются как по материнской, так и по отцовской линии.
П р и м е р 3. Осуществляют анализ ДНК у трех ягнят, два из которых родственные и один неродственный. Картины гибридизации у родственных особей очень близки и существенно отличаются от неродственного животного. Осуществляют анализ ДНК для трех поросят одного помета, показывающий, что при данных условиях разрешения картины гибридизации практически идентичны. Используют ДНК М13 для характеристики инбредных линий и определения межлинейных различий дрозофилы. ДНК трех линий одного вида дрозофилы (D. melanogaster) дают свою специфическую картину гибридизации. В то же время разные особи одной линии не отличаются друг от друга на картине гибридизации.
П р и м е р 4. Проводят анализ ДНК двух сортов ячменя Waxy и МБ-1 наряду с сходными полосами гибридизации наблюдают выраженные различия, демонстрирующие возможность идентификации сортов.
П р и м е р 5. Проводят анализ ДНК трех коллекционных штаммов Vibrio cholerae. Наблюдают характерные картины гибридизации, специфичные для каждого штамма, показывающие как их родство, так и различия.
(56) Teffreys A. T. at al. Nature, 1985, v. 317, p. 6040.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к генетической инженерии широкого круга живых объектов. Изобретение может быть использовано в криминалистике (идентификация личности, установление отцовства и материнства), в генетике и селекции сельскохозяйственных животных и растений для классификации сортов и пород, характеристики имбредных линий, в практической микробиологии для идентификации штаммов микроорганизмов. Целью изобретения является упрощение способа и распространение его на разные таксономические группы. Способ заключается в том, что осуществляют блотгибридизацию рестриктированной ДНК из живых организмов с меченной по фосфору ДНК фага М13.