Способ идентификации микроорганизмов

Оп Н-И Е731904 Сокгз Советских Социалистических Республик.03.77 (21) 2 6678,28-133.76 23) Приоритет - (32) 31.0 сударствеииый комите 31) 6 33) СШЛ СССР по делам изобретений и открытий(45) Дата опубликования описания 30.05(71) Заявитель ОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ООРГАНИЗМОВ 1 л следупептон3 Изобретение относится к области диагностической микробиологии, а именно к идентификации бактерий,Известен способ определения наличия микроорганизмов в биологическом материале путем посева на питательную среду с последующим контактированием выросших колоний с бактериоцином, инкубированием и учетом наличия или отсутствия роста 11,Однако известный способ является трудоемким, так как необходимо наличие специфического бактериоцина.Целью изобретения является упрощение способа.Эта цель достигается тем, что вырос шие колонии контактируют с бактериоцином К-типа из микроорганизмов таксономически несвязанного рода.Кроме того, в качестве бактериоцина используют пиоцин Рзсцдогпопаз аегцр- поза АТСС 29260, типированный как 611131.При этом идентифицируют микроорганизм Хегззепа допоггЬоеае.Для определения наличия микроорганизмов используют в качестве бактериоцина пиоцин К-типа (611131), полученный нз штамма Рзецс 1 отпопаз аегцрпоза АТСС 29260.Основная среда содержит вющие компоненты, г: протеозастранцы Барбара Хотан Иглевски(Дифко) 15; КгНРО 4 4; КНгР 04 1; МаС 15 и растворимый крахмал 1, рН среды составляет 7,2. Если среду используют для получения ппоцинов К-типа с помощью Р. аегцрпоза, то после автоклавирования добавляют глицерин 1 об. % и мононатриевую соль глутаминовой кислоты - 8,46 г/л.Если среду используют для роста ХеЬзепа зр., то после автоклавпровання добавляют ростовой фактор 1 об. %, идентичный по составу с обогатнтелем типа 1 зо /Иа 1 ех, и добавляют глюкозу - 5 г/л, ХаНСОз - 42 мг/л.Выращивают и очищают пноцин В-типа г 5 (611131) следующим образом,Заготовленную с вечера культуру Рзецдогпопаз аегцрпоза АТСС 29260 центрифугируют и повторно суспензируют до /1 первоначального объема в растворе, содер жашсм 0.8% ХаС 1 и 0,1% цистпн хлоргидрат при рН 6,5. 1 об. % посевной культуры используют для выращивания на качалке прп 37"С.Когда мутность культуры достигнет 2- примерно 150 ед. Клетта, добавляют митомпцин С при конечной концентрации 1 лкг/пьг. Выращивание продолжают до тех пор, пока не произойдет лизис культурьт. причем это происходит по истечении З 0 трех часов после добавления мптомицина С,50 Оргвнегзм не инду цированный.;) льтуру,: ндуцированную митомицином С, цсптрпфугируют с 2400 кратным ускорением в течение 30 мин для удаления клеточных остатков и пол)учаюдийся в результате отстаивания верхний слой обрабатывают хлороформом (5 об. %). Эта всплывшая наверх фракция и есть сырой пиоцин,Сырой пиоцин далее очищают путем лр.бавления 1 М МпСЬ (60 мл на 1 л лизата), примешивая при этом смесь к сырому пиоцину. После достижения рН 7,5 с гомощью 1 М МаОН полученный осадок удаляют ценврифугированием. Всплывшая цаверх фаза является очищенным пиоцином.Дальнейшую очистку проводят добавлением (ХН,)2 Ю 4 до 70%-ного насыщешя и культивированием в течение ночи при4 С.После центр ифугиров ания в течение 30 мин при 4 С осадок от центрифугиро.вания, содержащий компонент с пиоциновой активностью, растворяют в 50 мл 0,01 М грис-(оксиметил) -аминометан-(трис)- хлоргидрата рН 7,5, содержащем 0,01 М МдС 1, и 0,01 М МАЗО, и подвергают диализу в течение ночи при 4 С против 2 л того же буфера. При необходимости препарат осветляют центрифугированием в течение 90 мин. 5 Келатиноподобный осадок от центрифугирования осторожно растворяют в 20 мл буфера и хроматографируют на целлюлозе ДЕАЕ, предварительно промытой ви доведенной до равновесного состояния с помощью того же буфера В колонку размером 1,5 х 28 см вносят 8 мл образца пиоцина и адсорбируют в течение 1 ч. Колонку промывают 200 мл буфера лля удаления веществ, неадсорбированных на целлюлозе типа ДЕАЕ, Затем пиоцин элюируют с помощью 800 мм в 0,01 М буфере, Собирают фракции по б мл и анализируют на поглощение при 280 нм и на теоциновую активность.Фракции, проявляющие пиоциновую активность, диализируют против 0,01 М трисбуфера, рН 7,5 для удаления ИаС 1, а затем концентрируют с помощью ультрацентрифугирования в течение 90 мин,Типизацию пиоцина осуществляют, используя метод жидкой среды, описанный Джоном.Штаммы ИеЫзепа допоггЬоеае, которые испытывают на восприимчивость к пиоцину, выращивают в течение ночи в чашках с агаровой средой. Суспензию этих микроорганизмов приготавливают в разбавителе, состоящем,из 0,85/о ИаС 1 и 0,1% НС 1 (рН 6,4), и доводят до показанский Клетта, равных 50 - 60. Чашки с агаровой средой заражают с помощью тампона, погруженного в клеточную суспензию, Неразбавленные или серийно разбавленные препараты пиоцина (5 мкл) вносят на поверхность чашек с агаровой средой, Все чашки культивируют в течение ночи при 3 С с повышенным содержанием СО.Пиоцины были приготовлены для изучения под электронным микроскопом с по мощью метода негативного пятнистого окрашивания, Препараты пиоцина центрифугируют с ускорением в 100000 д в течение 1 ч, и осадок от центрифугирования ловторно суспендируют в малом объеме 1 М КН 4 СНз 02 (рН Я), Медные сеточки, покрытые формваром, вносят в каплю образца в течение 1 - 2 мин, а затем промокают досуха с помощью фильтровальной бумаги. Эти сеточки вносят затем в кап о/лю 1,5 /о -ного раствора фосфовольфрамата натрия (рН 7,0) в течение 30 с, Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой.Взаимодействие пиоцинов с,клетками 20 Иеззепа допогг)оеае обнаруживают поподобной методике. Спустя 30 мин после добавления пиоцина к жидкой культуре И. допоггЬоеае 72 Н 870, образец удаляют и обрабатывают так же, как это было опи5 сано. Препарат с негативно окрашеннымипятнами был изучен с помощью электронного микроскопа РСА (при 50 кВ) В табл, 1 даны результаты производ ства гонококкового фактора инпибирования,синтезированного во время выращивания Рзецйогпопаз аегцопоза АТСС 29260 в указанной среде. Добавление митомицина С (1 мкг/мл) вызывает широкий лизис куль туры в пределах 3 ч и приводит к 16-кратному увеличению концентрации фактора инпибирования, определенного путем титрования яа Рэеидогпопаз аегцрпоза Рр 7 и 1947, В таблице также показан титр фак штаммах Х, допогг 1 оеае типа ЛЪи 051тора ингибирования, изменяющийся с изменением различных штаммов Ие 1 ззепа допоггЬоеае, причем не наблюдается различий с колониальными вариантами еди ничного штамма. Примеч а ние. г) Митомицин С (1 мкг на1 мл среды) при последовательном разбавлении не был способен ингибировать рост указанных организмов при разбавлении 1:2 (О,б мкг/мл);65 б) 14,Р - не огрел, лилось(-, К 56 А 4 В 5 С 33 У 1 Х 5 С О 1 О О 1 1 О О О О О О 16 1 1 1 1 135 Хг.ага.са ; с Фактор ингибирования был частично очищен от всплывающих наверх жидких фаз культур Рзепс 1 оп 1 опаз аегцрпоэа штамма АТСС 29260, индуцированных митомицином С, по методике, описанной выше. Фактор ингибирования элюируют из целлюлозы ДЕЛЕ с помощью ХаС 1 градиента от 0 до 1,0 М, Обнаруживают два пика, содержащие фактор ингибирования. Главный пик (а) элюируется при концентрации ХаС 1 0,06 М,и обладает более, чем 90% -ной ингибиторной активностью, Слабый пик (б) элюируется при концентрации ХаС 1 0,91 М и обладает менее, чем 10%-ной активностью. Фракции, составляющие пик а, объединяют, диализируют против 0,01 трисхлоргидратного буфера (рН 7,5) для удаления ИаС 1 и концентрируют ультрацентрифугированием (100 ООО-кратное ускорение в течение 90 мин), Этот препарат используют в описываемых ниже испытаниях.Изучение с помощью электронного микроскопа препарата с негативно окрашенными пятнами из очищенного фактора ингибирования показывает, что частицы напоминают пиоцины К-типа как в несокращенном, так и в сокращенном состояниях. В несокращенном состоянии эти частицы имеют длину 11 5 нм и ширину 15,3 на. В сокращенном состоянии частицы состоят из внутреннего ядра (длиной 105 нм и шириной 6,5 нм), окруженного сокращенной оболочкой (длиной 44,4 нм и шириной 18,6 нм) . В сокращенном состоянии находилось 20 - 30% частиц, наблюдаемых в этих препаратах.Тип пиоцина как в частично очищениз рассеянных, так и нерассеянных заражений ингибируются. Однако ингибируются только 3 из 20 штаммов М, тпеп 1 пр 1 Ы 16 и 5 из 16 штаммов Х. 1 ас 1 ап 11 са. Не наблюдается какой-либо корреляции между серологической группой и ингибированием ых, так и в очищенных препаратах определяют по вышеописанной методике,причем результаты показывают, что модельне пзменяетс:, з; время очистки, Пиоцин5 относится к модели 611131.Действие пиоцина 611131 на рост клинического изолята Ме 1 взег 1 а допогг 11 оеае(штамм 72 Н 870).Действие аиоцин а н а рост клеток ми к1 О роорганизма было определено добавлениемразличных концентраций очищенного препарата к экспоненциально растущим культурам.При высоких концентрациях пиоцинаполное ингибирование роста, происходящеев пределах 1 ч, сопровождается широкимлизисом культуры. Изучение с помощьюэлектронного микроскопа показывает, чтомежду пиоцином и чувствительными клетками Хе 1 ззег 1 а допоггйоеае происходит непосредственное взаимодействие. Взаимодействие шюцина с клетками приводит к сокращению пиоцина.Спектр ингибирования пиоцина типа611131,Лликвотные части очищенного препарата пиоцина наносят в виде пятен на посевы,полученные из клинических изолятовХ. допогг 11 оеае. Зона ингибированяя отчетливо видна во всех изученных штаммах.Не наблюдается различий между колониями типа Ти Тиз одного и того жештамма. Включен также отрицательныйконтрольный тест продуцирующего штаммаЗ 5 Р, аегшрпоза АТСС 29260.Инпибирование различных зидов Ие 16- зег 1 а с помощью этого пиоцина показано этабл. 2, Все изоляты Х. допогг 11 оеае как ЧислоЧисло Серо. испыты. , чувствигруппа, вавшихся тельныштачгповштамиов М. гпеп 1 пр 11 йз. Ни один из других пяти4 О испытанных видов ненгибируется этим пиоцином. Быстрая идентификация Хе 1 ззег 1 а допоггйоеае,731904 ста на той части чашки, в которую былвнесен пиоцин,Этот метод может быть применен дляндентификации других бактерий,5 Таблица 3 Бактериоцин РЯ. аегпр- поза РЯОрганизм Чеззега допоггЬоеае+ + + + + + + + + + + метод типизации особенно полезен при эпидемиологических исследованиях, когда важно преобладание или появление новых штаммов, а также при определении обусловлена ли неудача обработии устойчи востью микроорганизма или повторным заражением новым типом микроорганизма.Дополнительные варианты изобретения описаны ниже,Идентификация М. допоггйоеае, используя пиоцины, меченые флюоресцеином. По этому методу пиоцины, производимые и очищенные так, как это описано вы ше, размечают флюоресцеином согласно методу Джонсона, Меченые таким образом пиоцины реагируют о подозреваемой М, допоггпоеае на предметном стекле, приготовленном,из клинического материала или из изолированных колоний из чашки с агаро вой средой. Избыток пиоцинов удаляют промывкой предметного стекла 0,02 молярным физиологическим (рН 7,2) буфером, буферированным фосфатом, и предметное стекло рассматривают под уф-микроскопом. 40 Клетки, имеющие типичную морфологию М. допогг 11 оеае и показывающие флюоресценцию, рассматриваются как положительные для Х. допоггЬоеае. Метод для быстрой идентификации Че 1 ззепа допогг 11 оеае может быть осуществлен по любой из следующих методик: пиоцин 611131 наносят в виде пятна в чашку с агаровой средой, содержащую биологический образец, который испытывается, или диск, пропитанный пиоцином, вносится в чашку, зараженную образцом, или же пиоцин, внесенный в одну половину чашки с расщепленной агаровой средой, заражается образцом, Вслед за культивированием осуществляют идентификацию микроорганизма в виде Х, допогг 1 оеае на основе зоны инпибирования, окружающей пятно, куда нанесен пиоцин, или ингибирования роТипизация Меззепа допогг 11 оеае, Типизация И. допогг 1 оеае и других ви дов Хе 1 ззепа включает использование нескольких типов пиоцина и основывается на ингибировании или неингибировании испытываемых микроорганизмов, Наблюдаемые результаты используются для идентификапии типа изолята путем соотнесения их с результатами, полученными с помощью целого ряда известных типов (табл. 3), Этот РЯ, аегпр- Р 5, аегия- РБ, аегпд поза поза АТСС поза РЯ29260 РЯИдентификация бактерий с помощью пиоцинов, меченых радиоактивным изото. пом.Радиоактивные пиоцины получают путем йодирования их изотопом " 1 с помощью метода с применением хлорамина Т. Их можно получить мечеными с Н или 4 С путем ввода конкретных меченых аминокислот в культивируемую среду до начала синтеза пиоцина в Рзеидогпопаз аегирпоза с помощью митомицина С, Пиоцины, производимые по этому методу, являются радиоактивными. Специфические бактерии легко идентифицируются путем взаимодействия радиоактивных пиоцинов с суспензией бактерий. Затем эту суспензию подвергают мембранной фильтрации или центрифугироваиию для отделения несвязанных пиоцинов от пиоцинов, которые связаны специфически с поверхностью бактериальных клеток, Фильтр или промытый клеточный осадок в пробирке после центрифугирования принимают затем во внимание, чтобы определить количество связанного пиоцина, который был меченым, Данные сравнивают со степенью неспецифического связывания, лю бое увеличение над уровнем неспецифического связывания показывает наличие неизвестного микроорганизма.+ аегцрпояа гЯ - 5аегцрпояа РЯ - 6аегцрпояа РА 1 А 8аегцрпояа РЯ - 7ЫЬгосЬо 1 ега Еа ТокЯегга 11 а гпагсеясецяогпопая ЬгдгорЬ 1 а оас 1 егоси Зас 1 егосп Час 1 егосп Ьас 1 ег 1 оси зас 1 ег 1 оси Зас 1 егоси оас 1 егоси 1:Ря 2:Ря 3:Ря 4:Ря 5:Ря 6: Ря 7: Лег Примечание 15 Ряс идогпопгя пеги пояаРя деги 111 поаРЯ. аеГици яа поп р.иил, цг 1 с яроо сияР". па 1 ориаР. и:а 1 ог;1 аг". яассп агсрЬ 1 иЯг 1;попеа ага .п 1 еЯа 1. ЬегоепЯа. Ьогпиги.а. сЬо 1 егаяи 1 яса 1. даЬ 1 епЯа. деегяогЯа 1. д 1 а 1 сагаЯа 1. дидЬеЯа 1. епегдяЯа. 1 опда Изобретение может быть использовано при идентификации антигенов, которые являются свойственными для бактерий таксокомически несвязанных родов, Как извест но, бактериоцины связываются с специфическими рецепторными участками на внешней поверхности бактерий. Эти рецепторные участки подвергаются также действию механизмов защиты хозяина и могут таким ооразом стимулировать производство антител, которые могут быть либо бактерицидного, либо опсонизирующего типов. Бактерии могут делить свойственные антигены. Эти свойственные антигены могут быть также бактериоциновыми рецепторными участками, поэтому взаимодействие бактериоцинов с разными видами бактерий может быть использовано в качестве индикатора разде. ляющихся антигенов (табл. 4), Это, в свою очередь, может быть использовано при выделении и очистке антигенов для производства вакцин, Таким образом, второстепенный антиген на одном микроорганизме может быть главным антигеном на другом поэтому может облегчать очистку и может быть получен в больших количествах. Способ может быть использован также для демонстрирования свойственных анти генов (или поверхностных компонентов) в клетках млекопитающих, Вследствие свойственной специфичности их рецепторов бактериоцины могут быть использованы вместо соединений, таких как лектины, или в методиках, включающих типизацию тка.;Изобретение может быть использованотакже при идентификации других бактерий.5 Таким образом, как это показано в та:.л. 4,бактериоцины из ИЬго с 11 о 1 егае, Аегогпаз Нус 1 горЫ 1 а и Яегга 11 а гпагсезсепз обычно перекрестно реагируют с таксономиче ки несвязанным микроорганизмом.1 О Предлагаемый способ позволяет упростить определение наличия микроорганизма с использованием любого бактериазича. Формула изобретения 1. Способ идентификации микроорганизмов в биолопическом материале путем госева на питательную среду с последующим 20 контактированием выросших колоний с бактериоцином, инкубированием и учетом наличия или отсутствия роста, о т л и : а к:- щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, выросшие колонии контактируют с бактериоцином К-типа из микроорганизмов та ксономически несвязанного рода.2, Способ по и, 1, отлич а ющи й сятем, что в качестве бактериоцина испсльзуют пиоцин Рзеис 1 огпопаз аегпрпоза АТСС ЗО 29260, тппированный как 611131.3. Способ по п. 1, отличающийсятем, что идентифицируют микроорганизм Хеззег 1 а допогг 11 оеае,731994 Состав ггель С. Малютина Техред А. Намышникова Корректор С. файн Редактор Т. Пилипенко Заказ 580/706 Изд. М 310 Тпргкк 522 ПодпнсноНПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий13035, Москва, Ж. Раушская наб., д. 4/5 Тип, Хгрьк. фил. поед, Патент Источник информации, принятый вонимание при экспертизе: 1. ".т, Ъо 11 апс 1 5. Кгаць Азугпр 1 огпа 1 с гпеп 1 пдососса 1 цге 1 пг 111 з. Розэ 1 Ь 1 е ргоесгкеа 1 це аоа 1 пз 1 сгопососса 1 Ыес.1 оп Ьу Ьас 1 ег 1 ос 1 п ргодцс 11 оп, ВгШэЬ Л. о 1 епего 1 орса 1 01 эеазеэ, 1973, 49, р. 511 - 512.