Способ получения вируса миелобластоза птиц

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для получения микроорганизмов, в частности вирусов миелобластоэа птиц в высоких титрах.Известен способ получения вируса миелобластоза птиц в высоких титрах в организме инбредных цыплят, свободных от патогенной микрофлоры. (Актуальные вопросы стандартизации лабораторных животных для медико-биологических исследований, тезисы всесоюзной конференции 1987 г, М., 1988, ч. 1, с. 38 - 41),Указанная технология отрабатывалась на 3 - 4-дневных цыплятах и позволяла получать титры вируса миелобластоэа птиц (ВМП) в среднем 3-5 х 1012 вирусных частиц в 1 мл плазмы крови при 100 заражаемости цыплят. Объем плазмы в расчете на одного обескровленного цыпленка составил 3,2 мл.Однако при заражении цыплят более старшего возраста не исключалось дальнейшее повышение титров вируса и объемов плазмы от одного обескровленного цыпленка, т.е. существовала возможность качественного и количественного совершенствования технологии (лабораторные животные для медико-биологических и биотехнических исследований, тезисы конференции 1990 г, М., 1990 г, с. 119),Для экспериментов согласно прототипу были выбраны 7 - 8-дневные цыплята. В серии пассажей на таких цыплятах показано, что титр вируса составляет в среднем 5 - 6 х 10 частиц в 1 мл и выделены отдельные образц 1 плазмы с титрами от 3,2 х 10 до12 1,2 х 10 частиц/мл. Заражаемость цыплят колебалась в пределах 95-100, .объем плазмы от одного цыпленка увеличился в среднем до 4,5 мл,К недостаткам указанной технологии следует отнести нестабильность высоких титров вируса и выхода увеличенных объемов плазмы, прогнозный характер результатов.Цель изобретения - повышение стабильности титров вируса и выхода увеличенных объемов плазмы,Указанная цель достигается тем, что в способе получения вируса миелобластоза птиц в высоких титрах, включающем внутривенное заражение беэлейкозных, инбредных 7-8-дневных цыплят дозой 0,2 мл при разведении нативной плазмы 10 2, полученной от индивидуальных цыплят, или смесью плазмы от нескольких 3 - 4-дневных цыплят с максимальными титрами вируса после 17- го пассажа с заражением в цевочную вену лапки и обескровливанием методом внутри- сердечной пункции на 11-13-е сутки после 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 заражения, заражение цыплят 7 - 8-дневного возраста производят 0,2 мл разведеннойдо 10- 10плазмы с исходным титром 5-,5 -2,х 10 частиц/мл, полученной от 31 пассажа12вируса на 3 - 4-дневных цыплятах, при этомв качестве доноров используют цыплят породы "Русская белая" разводки НИЛбиомоделей АМН СССР, селекционированных сприменением дозы вируса 0,2 мл в разведении нативной плазмы до 10 к заражению-зВМП в объеме 11 - 36 от общего их количества.Отличительными особенностями способа получения вируса миелобластоза птиц ввысоких титрах является заражение цыплят7 - 8-дневного возраста 0,2 мл разведенной-1,5 -2,5до 10- 10плазмы с исходным титром 5х 1 О частиц /мл, полученной от 31 масса 12жа, и использование в качестве доноровбезлейкозных цыплят породы "Русская бе-.лая" разводки НИЛбиомоделей АМН СССР,селекционированных с применением дозывируса 0,2 мл с разведением нативной плазмы до 10 на высокую чувствительность к-ззаражению ВМП в объеме 11 - 367; от общего их количества.В качестве объекта исследования использовались цыплята породы "Русская белая" разводки НИЛбиомоделей,селекционированные на высокую чувствительность к заражению ВМП, позволяющиеполучать максимально возможные титры вплазме крови цыплят и сохранять его биологическую чистоту,Инфицирующим материалом служил вирус миелобластоза птиц штамма ВА 1-А, полученный из Института вирусологии АМНСССР (первичный источник - лабораторияД.Бирда, США). Для заражения вирус вводили в цевочную вену лапки цыпленка, обескровли вали цыплят методомвнутрисердечной пункции на 11-13-е сутки,когда уровень миелобластозов в периферической крови достигал 50-60 Я, по отношению ко всем клеткам крови. Собраннуюкровь центрифугировали 15 - 20 мин при3000 об/мин при 4 С. У павших и обескровленных цыплят при патологоанатомическомвскрытии подтверждался диагноз на миелобластоз, Вирус вводили 3 - 4-суточнымцыплятам в дозе 0,2 мл при разведении нативной плазмы 10 . Хранение и транспор тировку плазмы осуществляли в жидкомазоте, в специальных флаконах, Исследования проводились с соблюдением требований стерильности, Основной критерийэффекта заражения - процент заболеваемости миелобластозом цыплят,Гематологическим критерием динамикиинфекционного процесса было число мие(56) Лабораторные животные для медикобиологических исследований, тезисы конференции, 1980 М., с, 119. Таблица 1 Динам;з заражаемости цыплят и титра ВМП при пассировании вируса на 3 - 4-дневных безлейкозных цыплятах породы "Русская белая"лоб нсквозных клеток, определяемых в мазках крояи, Для количественной оценки содержания ВМП е плазме испольэовалиспектрофотометрический метод определения т,тра вируса по АТФ-ной реакции. 5На 3 - 4-дневных цыплятах получалититр вируса е среднем,э х 10 частиц в 1 млг 12при 100 ,-ной заражаемости цыплят, Объемплазмы е расчете на цыпленка составил 3,2мл, эти показатели не менялись с 17 по 31-й 10пассажи ВМП (табл. 1, чертеж),Затеял нэ 7-8-дневных цыплятах получали плазму с титрами вируса 5-6 х 10 час 2тиц в мл при заражаемости цыплят 95-100;(,с увеличением обьегла плазмы от одного 15цыпленка до 4,5 мл (фиг, 1).Для стабилизации выхода плазмы с высокими титрали вируса и ее увеличеннымиобьемами снаряду с адаптацией вируса методом последовательного заражения плазмой 20с наивысшими титрами разных пассажейпроводилось селекционирование, направленное на выведение высокочувстеительной к ВМП линии кур разводки НИЛ ЭБМАМН СССР, первоначально на 3 - 4-дневных, 25а затем на 7 - 8-дневных цыплятах. Оценкаособей, входящих в группу производителейследующей генерации, проводилась по потомству, т,е, по чувствительности цыпляткаждой курицы к ВМП, Степень чувствительности цыплят определялась по количеству дней, прошедших со дня заражения домомента гибели животных от миелобластоза при дозе Дю которая составила 0,2 млнри разведении нативнсй плазмы 10 . 35-зЦипляга, паеинле на 14-15-е сутки, считались еысокочуесгеительными, на 16 - 17-есутки - чувствительными и на 18-21-е сутки- низкочуестеигельными. Цыплята, у которых к 21-му днго после заражения не наблодалось накопления миелобластозных клеток, оценивались как устойчивьмп к ВМП.Способ поясняется чертежом,По степени чувствительности цыплята распределялись следующим образом, ь;высокочувствительные (14-15 день) 11-36 чувствительные(18 - 21 день) 23-29 Эти данные использовались для составления схем скрещивания при формировании новой генерации птицы, При этом учитывали два показателя: общий процент заражаемости цыплят каждой курицы и число цыплят. заболевших в ранние сроки (11- 15-й день) после заражения,При применении на таких цыплятахуоэ вируса 0,2 мл при разведении 10 -10у 7 - 8-дневных цыплят удалось достичь 95 - 100заражаемости и возможности обескроеливания основной массы цыплят на 11-13-сутки (табл. 2). Последнее позволяет получить от этой группы стабильные обьемы плазмы с высокими титрами (табл. 3),Установлено, что наиболее экономически целесообразно испольэовать для достижения поставленных целей цыплят с высокой чувствительностью к ВМП,Использование способа получения вируса лиелобластоза птиц в высоких титрах позволяет обеспечивать выход плазмы на 7 - 8- цневных цыплятах с титрами вируса 7 х х 10 частиц/мл при стабильных увеличенных ее обьелах 4,5 лл на обескровленного цыпленка2001102 Продолжение табл, 1 Таблица 2 Динамика обескровливания заразившихся 7-8-дневных цыплят при введении технологических доз ВМППассироаание ВМП на 7 - 8-дневных безлейкозных цыплятах породы "Русская белая" разводки НИЛ ЭБМ АМН СССРФормула изобретения СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСА МИЕЛОБЛАСТОЗА птиц, включающий внутривенное заражение 7 - 8-дневных цыплят с последующим их обескровливанием и выделением вирус- содержащей плазмы, отличающийся тем, что заражение цыплят проводят плазмой цыплят, инфицированных в 3 - 4-суточном возрасте породы "Русская белая". свободной от вирусов лейкоза саркомного комп.лекса птиц, взятой на 31 пассаже с титром 5 х 10 частиц 1 мл и разведенной до 1012в дозе 0,2 мл.и г 4 б В го г ж тбВкуйа дыряв тмин арИВвг, Ь оставитель И. Тарееехред М,Моргентал Редак рректор О. Кравцова Заказ 311 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагари э, 1 ь ь )5 г 11 О 8 -7 Тираж Подписно НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5