Способ концентрирования вирусов

2) 12.12,89 здании средств профилки вирусных инфек прнагност тик ущность спензия ве ест, Бахуташалишин В.В. овательский Гусев А.А .И., Мих но-иссле изобретобрабавом16000концеотдел ц 1 хсйо В. е а.АгсЬ.т.35, 1, р.104-113.НЦЕНТРИРОВАНИЯ итра- 8 е: в русология, биотехнонтри рован ия вирусо Комитет Российской Федерации о патентам и товарным знакам(71) Всесоюзный научящурный институт(19) Я 3 (11) 1834289 (1 з) А 1 ения: виру ссодержащая су тывается преципитирующим щполиэтиленполиай ином с мол.м. Д, который добавляют до конечной трации 0,05 - 0,2% с последующим нием осадка и его ресуспендированизаданном обьеме, Полученные конты сохраняют свою активность при С, 5 табл.1834289 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Изобретение относится к вирусологии, точнее к способам концентрирования вирусов, и может быть использовано при изучении их физико-химических и биологических свойств, при создании средств специфической профилактики и диагностики вирусных инфекций сельскохозяйственных животных. Целью изобретения является снижениепотерь вируСов",й,по)удушение экологичностиспособа, " "П р и;м е,цф,успе 4 зию лапинизированного вируса ящДа,ЬдЭя7 пассажа готовят из замороженных тушек крольчат,хранившихся в течение 2 недель при -40 С.;, Вирусное сырье измельчают на коллоидноймельнице в смеси с аммиачным буфером (рН7,6 - 7,8) в соотношснии 1:10, Размол и суспендирование проводят в течение 10 мин(буфер предварительно охлажден до 4 С).При постоянно включенной коллоидноймельнице в суспензию добавляют 5% хлороформа объем/объем) и продолжаютэмульгирование смеси в течение 15 - 20 мин.Полученную суспензию осветляют центрифугированием при 2000 - 3000 об/мин в течение 20 - 30 мин, Очищенную такимобразом от балластных белков и.жиров суспензию вируса инактивируют 0,0350 -нымформальдегидом при температуре 25 - 26 Си рН суспензии 7,8 - 8,0 в течение 48 ч. Дляосаждения вируса в суспензию вносят полиэтиленполиамин (ПЭПА) мол.м, 16000 Д, вконечной концентрации 0,05 и рН суспензии устанавливают в пределах 7,2 - 7,4. После экспозиции в течение 18 - 24 чнадосадочную жидкость декантируют, аосадок используют в качестве антигена,Предлагаемый способ позволяет получать20 - 50-кратную концентрацию ящурного антигена.П р и м е р 2. Суспензию лапинизированного вируса ящура Азия - 1 7 пассажа го"товят, очищают от балластных белков ижиров, инактивируют и концентрируют так,как описано в примере 1. Отличие состоит втом, что для осаждения вируса в суспензиювносят ПЭПА (мол, м, 16000 Д) в конечнойконцентрации 0,1 ,П р и м е р 3, Суспензию лапинизированного вируса ящура Азия7 пассажа готовят, очищают от балластных белков и жиров, инактивируют и концентрируют так, как описано в примере 1, Отличие состоит в том, что для осаждения вируса в суспензию вносят ПЭПА (мол,м. 16000 Д) в конечной концентрации 0,2 . П р и м е р 4. Энтеровирус свиней 7 серотипа инокулируют в культуре клеток СПЭВ и инкубируют при 37 С в течение 24 ч. После проявления полного ЦПД матрасы промораживают. К 1000 мл вируссодержащей культуральной жидкости добавляют 50 мл хлороформа, энергично эмульгируют при 4000 об/мин в течение 5 мин. Денатурированный балластный бел эк отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. К надосадочной жидкости добавляют 2 мл ПЭПА (мол,м, 16000 Д), что составляет 0,2 его конечной концентрации, перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, Осадок ресуспендируют в 1/10 исходного объема культуральной среды, Полученный препарат титруют на культуре клеток и в дальнейшем используют для диагностических целей. Из данных, приведенных в табл. 1, видно, что увеличение концентрации ПЭПА мол,м, 16000 Д) приводит к образованию более массивного осадка и сопровождается снижением инфекционности в надосадочной жидкости, что косвенно свидетельствует о преципитации вируса и выпадении его в осадок. Согласно полученным данным наиболее полное осаждение вируса ящура Азия - 1 из вируссодержащей суспензии происходит при 0,1 и 0,2 -ной концентрации ПЭПА(мол,м. 16000 Д). Потери вируса в этом случае, судя по инфекционной активности надосадочной жидкости, составляли 0,74 и 0,110 соответственно,Приведенные в табл, 2 данные показывают, что более полное осаждение вируса в процессе концентрирования достигается внесением в очищенную суспензию ПЭПА (мол,м, 1600 Д) в сравнении с осаждением вируса в присутствии ПЭГ в концентрации 10%. Различия существенные и статистически достоверны. Данные, представленные в табл. 3, свидетельствуют о том, что образцы вакцины, приготовленные из концентрата, полученного предлагаемым способом, в 3 раза эффективнее, чем из препарата, полученного по способу-прототипу. Как видно из табл. 4, эмульсионные вакцины, приготовленные из концентратов, полученных с помощью ПЭПА(мол,м. 16000 Д) формируют напряженный иммунитет у свиней.В табл, 5 представлены данные, свидетельствующие о том, что предлагаемый способ позволяет сократить потери вируса в процессе концентрирования.1834289 Таблица 1 Влияние количества ПЭПА(мол, м. 16000 Д) на концентрирование лапинизированного вируса ящура Азия - 1Таблица 2 Сравнительная оценка эффективности концентрирования лапинизированного вируса ящура Азия - 1 с помощью ПЭПА, мол.м. 16000 Д (предложенный способ) и с помощью ПЭГПредлагаемый способ имеет следующие технико-эономические преимущества по сравнению со способом-прототипом:снижает потери вирусов в 23 - 36 раз; повышает в 3 раза иммуногенность образцов вакцин из концентрированных препаратов;является экологически безопасным.,Таблица 3Результаты сравнительных испытаний образцов противоящурной вакцины из лапинизированного вируса Азий, приготовленных из концентрированных антигенов, полученныхпредлагаемым способом и способом-прототипом10 1834289 нечн няя прав е заболеванию П р и ме ч а н и я и/и - пе правая, з/л - задняя левая;- - животное противостоящ + - заболевание животное Продолжение табл. 3 ь, и/л - передняя левая, з/и - задняя183428912Таблица 4Изучение иммуногенной активности противоящурной эмульсионной вакцины из лапинизированного вируса ящура Азия - 1, приготовленной из концентрированного ПЭПА (мол.м.16000 Д) антигенаЧислитель - количество незаболевших ящуром животных;наменатель - количество животных в опыте.аблицравнительное изучение, способов концентрирования энтеровируса свиней (7 серотип13 1834289 14 Составитель С.ПыловаТехред М,Моргентал Корректор Н.Король Редактор Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж, Раущская наб., 4/5 Заказ 136 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Формула изобретения СПОСОБ К ЧЦЕНТРИРОВАНИЯ ВИРУСОВ, включающий добавление в вируссодержащую суспензию преципитирующего агента, отделение осадка с последующим его ресуспендированием в заданном объеме, отлвиающийся тем,что, с целью понижения потерь вируса и повышения экологичности способа, в качестве преципитирующего агента используют полиэтиленполиамин с мол. м.5 16000 Д, который добавляют в вируссодержащую суспензию до конечной конце трации 0,05 - 0,26.