Химически модифицированный носитель на основе кремнезема и способ его получения

(54) ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦ СИТЕЛЬ НА ОСНОВЕ КРЕМНЕ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯе(57) 1.Химически модифи носитель на основе крем метрами пор 10-250 нм, на поверхности группы ф-бН 2 - О - бН 2 - б для иммобилизациных соединений. ированныйезема с диаодержащийрмулыН - Ю 21097558 Изобретение относится к способу получения химически модифицированных кремнеземных носителей и может быть использовано для иммобилизации биологически активных соединений - 5 Ферментов, их ингибиторов, кофакторов.Известны модифицированные органическими соединениями кремнеземные носители, используемые для иммобилизации биологически активных веществ ЯОднако известные носители предназначены для иммобилизации соединений, содержащих лидць определенные функциональные группы и во многих случаях их необходимо дополнительно активировать.Наиболее близким к предлагаемому является носитель (2( на основе макропористого кремнезема,. содержащий на поверхности группы формулы 2 О Указанное соединение привито кповерхности кремнезема гидролитичесски прочной системой связей е Бд-0 - Вд - С. Эпоксидные группы но/сителя способны реагировать с Функциональными группами ( - ОН - ННгЗН 1 биологически активных молекул,что определяет возможность использования данного носителя для иммобилизации широкого набора Ферментов,ингибиторов и др,Носитель с привитыми эпоксигруппами получают обработкой кремнеземараствором у -глицидилоксипропилтри-этоксисилана в воде или органическомрастворителе (214 ООднако при иммобилизации на данномносителе биологически активных молекул, содержащих тиольные группы, помимо эффекта иммобилизации наблюдается потеря биологической активнос-45ти. При этом полученные препараты иммобилизованных биологически активныхмолекул данного химического строенияпод воздействием кислорода быстро теряют свою активность, так как тиольг 5 О для иммобилизации биологически активных соединений.Способ получения химически модифицированного носителя на основе кремнезема, включающий обработку кремнезема " -глицидилоксипропилтризтоксисиланом до содержания на поверхности носителя эпоксидных групп в количестве 15-1000 мкмоль/г обработанный-глицидилоксипропилтриэтоксискланом кремнезем дополнительно обрабатывают тиоцинатом щелочного металла или тиомочевинй в количест" ве 20-100 моль на 1 моль эпоксигрупп, в среде апротонного растворителя при 50-100 Со 2,Способ получения химически мо-" дифицированного носителя на основе кремнезема, включающий обработку кремнезема- глицидилоксипропилтриэтоксисиланом до содержания на поверхности носителя эпоксидных групп в количестве 15-1000 мкмоль/г, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что обработанный -Глицидиоксипропилтриэтоксисиланом кремнезем дополнительно обрабатывают тиоцинатом щелочного металла или тиомочевиной в количестве 20 - 100 моль на 1 моль эпоксигрупп в среде апротонного растворителя при 50 ные группы легко окисляются кислоро-, дом, При обычных условиях иммобилиза ции (водный раствор, воздух), а также при хранении готового продукта, иммобилизируемое вещество (или иммобилизованное на носителе вещество) соприкасается с кислородом, что и приводит к потере их биологической активности.Для избежания данного нежелательного явления, процесс иммобилизации биологически активных молекул, содержащих тиольные группы, на носителе известного строения обычно осуществляют в инертной атмосфере или в присутствии восстанавливающих агентов 2-меркаптоэтанола, дитиотреитола. Последние снижают выход и загряз няют целевой продукт.Цель изобретения - получение химически модифицированного носителя на основе кремнезема для иммобилизации биологических соединений, в том числе биологически активных молекул, содержащих тиольные группы.Поставленная цель достигается тем, что химически модифицированный носитель на основе кремнезема с диаметрами пор 10-250 нм, содержащей на поверхности группы формулыСущность способа заключается в том, что носитель, содержащий на ,поверхности эпоксидные группы в количестве 15-1000 мкмоль/г обрабатывают в соответствии со схемой5м (.")би Р-Фг) - О-бНг-бН-Нг+г Ф=бвн,) О.гМфОУ О Р-(бНг);, О-Скг - (.Н-ба+Х где Р - кремнезем;М - щелочной металл.15Носитель общей формулы (1) получа. ют с выходов 80-100 в зависимости от структуры кремнеземной матрицы и условий реакции,Носитель представляет собой макропористый кремнеземный материал, со держащий на поверхности тиирановой группы в количестве 15-460 мкмоль/г носителя. Тиирановые группы носителя как и эпоксидные группы, способны реагировать с нуклеофильными Функциональными группами биологически активных молекул, что приводит к иммо- билизации последних.Иммобилизация протекает по следую З 0 щей схеме 1 (-г) - О ("Бг -Нг+ НУ-1 8 Р-(Нг- О-бНг - 1 Н - бНг-Ч - В 3511 Н где Р - кремнезем;6 - молекула биологически актив ного вещества;( - О, НН,Таким образом, в процессе иммобилизации биологически активных молекул на носителе общей ФормУлы (1) 45образуются свободные тиольные группы. Образование этих групп позволяетиспользовать носитель для иммобилизации активных молекул, содержащих тиольные группы; свободные тиольныегруппы, находящиеся на поверхностиносителя, служат в качестве восстанавливающего агента,Полученный модифицированныйкремнеземный носитель общей Формулы(1) в процессе иммобилизации исполняет две функции: матрицы для иммобилизации и восстанавливающего агента.Способ получения носителя осуществляется следующим образом. 60Обработку исходного носителя, содержащего эпокси-группы, проводятизбытком тиоцината щелочного металла или тиомочевины (на 1 моль эпок-сидных групп исходного вещества используют 20-100 молей соответствующего агента), обработку исходного вещества проводят в среде полярного апротонного растворителя, например диметилформамида (ДМФА, диметилсульфоксида (ДМСО) и др., при 50 100 ОС.При мольном соотношении тиоцината щелочного металла или тиомочевины к эпоксигруппам меньше чем 20:1 снижается выход реакции, соотношение больше чем 100:1 нецелесообразно.При температуре меньше 50 С знаО чительно увеличивается время проведения реакции. При температуре выше 100 С протекают побочные реакции, приводящие к разрушению тиирановых групп.Применение протонного растворителя приводит к раскрытию тиирановых групп до тиольных.Полученный модифицированный кремнеземный носитель общей формулы (1) представляет собой белое вещество в Форме гранул сферической или нерегулярной Формы, нерастворимое в воде и органических растворителях, которое разлалается в концентрированных щелочах и в растворе фтористого водорода.Структура нового соединения подтвержена элементным анализом, титриметрическим определением тиоэпоксидных групп.П р и м е р 1, 10,0 г силохрома С, модифицированного-глицидилоксипропилтриэтоксисиланом и содержащего 130 мкмоль/г эпоксидных групп, суспендируют в 50 мл диметилформамида (ДМФА) и при перемешивании добавляют раствор реагента, содержащего 5,8 г (бо моль) тиоцината калия в 50 мл ДМФА (соотношение 50:1). Перемешивают при 80 С в течение 2 ч,офильтруют. Нерастворимый продукт про. мывают последовательно ДМФА, холод-. ной водой и ацетоном до полного удаления растворимых компонентов. Сушат в вакуумэксикаторе 5 ч.Получают 10,0 целевого продукта, Найдено, Ъ : Б - 0,38Вычислено,%: Б - 0,35Содержание титрируемых тиопоксидных групп 112 мкмоль/г.Выход по Функциональным группам 93 О. П р и м е р 2. По примеру 1 осуществляют синтез носителя, изменяятемпературу реакции, соотношениереагентов и тип исходного кремнеземного носителя,В таблице представлены характернотики носителей в зависимости от условий обработки (тип и количество редгента,температура, растворитель,время реакции).1097558 Содержаниеэпоксигрупп,мкмоль/г Модифицированный реагент Исходныйкремнезем Примеры моль эпоксигрупп Силикагель,нм) 100 КБСБ 2,СиликагельБС( ЧН ) 90 50 ДМСО П р и м е р 3. 1,0 г модифицированного носителя, полученного по примеру 1, суспендируют в 10 ш Фосфатного буферного раствора (рН 7,6) в котором растворено 10 мкмоль трилона Б, смесь встряхивают 15 минДобавляют 100 мг трипсина, растворенного в 10 мл буферного раствора, и выдерживают смесь в течение суток .при 5 С, периодически встряхивая.оПродукт Фильтруют, промывают Фосфат ным буферным раствором и дистиллированной водой. Продукт содержит 38 мг белка на 1 г сухого веса, удельная активность иммобилизованного трипсина 42 ед/г. 15П р и м е р 450 мг уреазы в бикарбонатном буфере (10 мл 0,05 М, рН 8,б) инкубируют с 5,0 модифицированного кремнеземного носителя, полученного по примеру 1, при 2-5 Со в течение 2 сут, Продукт Фильтруют, промывают буферным раствором с добав лением 0,5 М НаС 1. Продукт содержит 8 мг/г белка, удельная активность 70 ед/г. 25П р и м е р 5, Образец препарата, полученного по примеру 4, инкубируют в фосфатном буферном растворе (0,01 М, рН 7,5) при 15 С. В аналогичных условиях инкубируют уреазу, иммобилизованную на носителе, полученного по прототипу. Через определенныепромежутки времени определяют уреазную активность препарата.На чертеже изображена зависимостьудельной активности уреазы от времени хранения.Кривая 1 описывает изменение удельной активности уреазы, иммобилизованной на предлагаемом носителе, криваяЬ уреазы иммобилизованной на носителе - прототипе.Таким образом, предлагаемый носитель за счет возникновения тиольныхгрупп при иммобилизации соединенийпозволяет получать препараты иммобилизованных биологически активных веществ более устойчивые к окислениюи сохраняющие свою активность на высоком уровне длительное время,Технико-экономическая эффективность изобретения состоит в том,что использование предлагаемого носителя для иммобилизации биологическиактивных соединений позволит расширить ассортимент иммобилизованныхпрепаратов, в частности биологическиактивных веществ, содержащих тиольные группы. Количество Растворитель реагента,моль на 1Заказ 4130/18 Тираж 464 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 Филиал ППП "Патент", г,ужгород, ул Проектная, 4 Силикагель,