Способ получения пептидов или их кислотно-аддитивных солей

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ БЛИН 37/02 1)4 С 07 К 7/06, А Н ПАТЕНТУ(31) (32) (33) (46) (71) (СВ) ед он (СВ)8.8)К. Пептид116,Вилкин4.07(0 Э, Любк Сэмюель547.964Шредер1967, ч М.; 56 с. Изоб ение отн пептидов сится к способуили их кислотноновых биологичесний, которыение в медицине. получен аддитивных солей - ки активных соедин могут найти примен Цель изобретения новых производи малотоксичных ой противодиарей- способ получех в ряду пептии обладающих выной, противокашле ой активностью, е сокращения:д; ТНР - тетра- дициклогекснл 1 "оксибензотриорфолин, ЭСЧида кислоты в со 8, Смесь0,880 аммиак ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ИСАНИЕ ИЗ ЗО,ОЗ,89. Бюл. У 12Дзе Белкам фаундейшн(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ ИЛИих кислотно-Аддитивных солеЙ(57) Изобретение касается производства пептидов, в частности пептидаф-лы 1 Н-Туг- Х-С 1 у-РЬе(4-Ю)-Рго"-НН, где Х=Р-Мег. или Р-Ме(0), илиих кислотно-аддитивных солей, кото"рые как биологически-активные ве- ,вой и анальгетнческ Приняты следующи РМР - диметилформами г рофуран, ОСС 1 -к рбодиимид, НОВТ -азол, ЩМ - И-метилмЯО 147019 щества могут быть использованы в медицине. Цель - создание новых более активных и менее токсичных веществ указанного класса. Синтез пептида ведут реакцией трипептида 11 с дипептидом П 1 Вос-Туг-Х-С 1 уОН (11) и Н-РЬе(4-ИО)-Рго-У (111), где Х - Указано; У = НН или ОСН . Полученный пентапептид при необходимости (когда У .= ОСН обрабатывают аммиаком (перевод в НН-группу) с последующим отщеплением защитной группы(Вос) и выделением целевого продукта в свободном виде или в виде кискпотно"аддитивной соли. Новые пептиды обладают противодиарейной, противо-кашлевой и анальгетической активностями при дозах 0,02-0,03 мг/кг, 10 мг/кг н оО мг/кг соответственно при токсичности Ю р 500 мг/кге1 табл.-дициклогексилмочевина, ВОС - третичный бутилоксикарбонил.Хроматографию осуществляют в тонком слое силикагеля на пластинах фир"мы Мегс с использованием следующихсистем растворителей,2, Смесь н-бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 3:1:1,3. Хлороформ:метанол:32%-ная уксусная кислота 120:90:40, 4 хлороформ:еметанол:32%-ный аммиак 120:90:40.7. Смесь хлороформа, метанола и32%ного водного раствора уксуснойотношении 120:90:5.хлороформа, метанолаиа в соотношении 120:90:5.З 14701994Высокоразрешающую жидкостную хро- смесь ацетонитрила и 0,1 М ацетата матографию проводят на колонках; аммония, рН 4,0, Скорость протока Еог"вах С, 4,6 мм х 25 см, в ка мл/мин, определение при длине волчестве подвижной фазы используют5ны 254 нм.Схема 1ей дЮдОС е-РЬе(4 БО)РгоНН.ВОС-Р-Иес. 01 у, ОИе (1).СНА-соль ВОС-Р-Иет,(28,38 г) аус пендируют в этилацетате (150 мл) и смешивают полученную суспензко с раствором КНЗО+ (13,5) в воде(75 мл). После полного растворения органическую фазу отделяют, двазды промывают водой (2 хб 0 мл), высушивают над безводным И 880 и концентрируют. Полученную маслянистую жидкость растворяют в тетрагидрофуране (90 мл), охлаждают раствор до -25 С и обраба-,55 тывают И-диметилморфолином (6,66 г) и изобутилхлорформиатом (8,60 г).Реакционную смесь перемешивают в течение 2 мин при -15 С и затем обрабатывают предварительно охлажденнымдо -25 С раствором С 1 у ОМеНС 1 (7,53 г) и И-метилморфолнна (6,06 г) в диметилформамиде (90 мл), После вы держки в течение 2 ч при -15 С реакционную смесь переносят в ледяную баню, обрабатывают 2 И раствором КНСО (72 мл) и перемешивают в течение 30 мин. После этого растворитель отгоняют в вакууме, а остаток распре деляют между этвпацетатом (350 мл) и водой (75 мл). Органический слой затем промывают 5 Ж-ныл раствором лимонной кислоты (2"50 мл), 5 Х-ным рас раствором ЯаНСО(250 мл) и водой (2 ф 50 мл). Экстракт высушивают над безводным М 8804 и упарнвают досуха, после чего сухой остаток растираютс петролейным эфиром.5 14Выход: 18,12 г (94% от теоретич.).Результаты тонкослойной хроматографии: одно пятно в 2,7,8.Н, П-МеС,С 1 у, ОМе НС 1 (2).ВОС-Р-МеС,С 1 у. ОМе (1) (18,1 г)суспендируют в анизоле (150 мл) и обрабатывают полученную суспензиюсмесью М НС 1 и уксусной кислоты(440 мл), Смесь перемешивают при.комнатной температуре в течение 30 мин,Образующийся продукт осаждают путемдобавления сухого эфира, отделяютего фильтрацией и тщательно промывают сухим эфиром. Полученный сыройпродукт растворяют в воде (450 мл)и раствор дважды промывают эфиромдля удаления остатков анизола. Водный раствор вымораживают. В результате получают 13,77 г продукта (выход 95 Х от теоретич,), Результатытонкослойной хроматографии: чистыйпродукт (2,7,8).ВОС.-Туг.Р-Ме.С 1 уОМе (3),ВОСТ-Туг (16,59 г) растворяют втетрагидрофуране (80 мл), охлаждаютдо -25 С и добавляют к нему ГЕ-метило,морфолин (5,96 г), а затем при быстром перемешивании иэобутилхлорформиат (7,69 г). После выдержки в течение 2 мин при -15 С к смеси добавляют предварительно охлажденныйраствор В-МеС 1 у,.ОМе.НС 1 (13,77 г)и ГЕ-метилхлорформиата (5,42 г) в диметилформамиде (80 мл) и продолжаюто,перемешивание при -15 С в течение2,5 ч, Затем смесь помещают в ледяную баню и обрабатывают в течение30 мин 2 М раствором КНСО(65 мл).Остаток, полученный после отгонкирастворителей в вакууме, растворяютв смеси этилацетата (360 мл) и воды(70 мл). Органическую Фазу отделяюти промывают 5%-ным раствором лимонной кислоты (2"50 мл), 5 Х-ным раствором ГЕаНСО(2"50 мл) и водой (2 ""50 мл), После высушивания (МАЗО) иудаления растворителя твердый остаток растирают с эфиром, В результатеполучают 21,16 г (81,6% от теоретического выхода) защищенного трипеп-тида. По данным тонкослойной хроматографии (2,7,8), полученный продуктне содержит примесей.ВОС-Туг,В-Ме.С 1 у (4),Защищенный трипептид (3) (21, 1 г)растворяют в смеси метанола (350 мл)и воды (150 мл) и проводят омылениепутем обработки 2 М раствором ЕЕаОН .(55 мл). Протекание реакции контро 701996 м 2, + 1,0формамид),1,3формамид).Рассчитано,%: С 5ГЕ 8,66.Найдено, %: С 52,ГЕ 8,53.(20,6 г). Смесь выдерживают в течеоние 30 мин при -5 С, в течение которых к ней добавляют раствор Рго-ОМе,НС 1 (16,55 г) и ГЕ-метилморфолина(10,1 г) в диметилформамиде (30 мл),Реакционную смесь перемешивают в теочение 20 ч при 5 С и затем отфильтровывают от дициклогексилмочевины,После упаривания в вакууме получаютмаслянистую жидкость, которую растворяют в этилацетате (1500 мл) и про 45 50 55 лируют с помощью тонкослойной хроматографии (7). Установлено, что реакция заканчивается через 45 мин, После окончания реакции метанбл отгоняют в вакууме, водный раствор охлаж.дают льдом и нейтрализуют 1 М раствором НС 1 (110 мл), Выпадающий в осадок продукт отфильтровывают, промывают несколько раз водой и высушивают над РО. Выход: 20,18 г (98% оттеоретич.). Результаты тонкослойнойхроматографии: одно пятно в 2,7,8.Рассчитано,Х: С 53,73, Н 6,61,ГЕ 8,96.15С Н,ГЕ,ОБНайдено,%: С 53,55, Н 6,62,ГЕ 8,76.ВОС-Туг. П-Ме 1. (0) . С 1 у (5) .Раствор ВОС-Туг.П-Ме,С 1 у ( 5,48)в метаноле (120 мл) обрабатываютдвумя эквивалентами перекиси водорода (2,7 мл 29,4%-ного раствора).Протекание реакции контролируют спомощью высокоскоростной колоночной 25жидкостной хроматографии, После выдержки смеси в течение 20 ч при комнатной температуре ее упаривают досуха и растирают остаток с эфиром. Выход: 5,46 г (96,5% от теоретического). Т.пл. 186=188 С (с разложением).мывают 5%-ным раствором лимонной кислоты ( 2"50 мл), 5%-ным раствором ИаНСО(2 х 250 мл) и полунасыщенным раствором МаС 1 (2"250 мл). Органи 5 ческую фазу высушивают и концентрируют до 500 мл. Выпадающий осадок дициклогексилмочевины отфильтровываут, а фильтрат упаривают, получая в результате смолу, которую не идентифицируют.Н,РЬе (Ю ). Рго.ОМе,НС 1 (7).Защищенный дипептид (21,41 г) растворяют в этилацетате (300 мл) и охлаждают полученный раствор до 0 С, после чего пропускают. через неого сухой газообразный хлористый водород в течение 45 мин, поддерживая температуру 0 С. Затем раствор концентрируют до 50 мл и разбавляют сухим эфиром (00 мл)После вымораживания продукт отфильтровывают, тщательно промывают сухим эфиром и высушивают над смесью РО и ИаОН.Выход: 15,64 г (85% от теоретич.) Т.пл. 145-148 С. Ы,5, 15 7 д (С Ы - , 17,6 (С=1,Рассчитано,%: С 50,35; Н И 11,75. МеОН).МеОН),30 С, Н,ИОС 1Найдено,%: С 50,03, Н 5,81,Н 11,45,35ВОС-Туг.Р-Мег (О). С 1 у.РЬе (Ю.),(1,0 г) в диметилформамиде (30 мл)охлаждают до -5 С, после чего обрабатывают его 1"оксибензотриазолом(0,56 г) и дициклогексилкарбоднимидом (0,42 г). Смесь перемешивают во,течение 40 мин при -5 С, затем добавляют к ней раствор Рпе (ИО).Рго, 45(0,21 г) в диметилформамиде (5 мл)и проводят реакцию сочетания при5 С в течение 20 ч. Выпадающий осадок дициклогексилмочевины отфильтровывают, а фильтрат концентрируют ввакууме. Сырой продукт распределяютмежду этилацетатом (100 мл) и водой(20 мл). Органический слой промывают 5%-ным раствором лимонной кислоты(220 мл) и водой (2 л 20 мл), высушивают над безводным МАЗО и упаривают, получая в результате аморфный твердый остаток, который после растирания с эфиром весит 1,0 г (62 Х оттеоретич. выхода). По данным тонкослойной хроматографии (2), в полученном продукте присутствует некотороеколичество дициклогексилмочевины,дальнейшую очистку не проводят.ВОС-Туг,Р-Мег (0) .С 1 у.РЬе (Ю 2) .(150 мл), раствор охлаждают в смесильда с солью и насыщают аммиаком,После этого колбу закрывают и оставляют смесь в течение 6 дней при комнатной температуре. Затем после тщательного удаления аммиака и метанолаобразующийся продукт экстрагируютсмесью этилацетата и эфира. Выход:0,81, г (83% от теоретич.). По даннымтонкослойной хроматографии (2,7,8),полученный продукт содержит некоторое количество дициклогексилмочевиныи небольшое количество исходногоматериала. Полученный продукт используют на следующей стадии без дополнительной очистки,Н,Туг.Р-МеТ (0).С 1 у,РЬе (Ю)..РгоМН(0,81 г) суспендируют в анизоле (14 мл) и обрабатывают суспензию одномолярной смесью НС 1 и уксусной кислоты (80 мл), После выдержкиреакционной смеси в течение 45 минпри комнатной температуре ее упаривают досуха и остаток растирают сэфиром. Полученный продукт подвергают очистке с помощью ионообменнойхроматографии на колонке 2,5 ф 25 см,заполненной карбоксиметилцеллюлозой,Элюирование осуществляют при линейном градиенте 0,005-0,2 М ацетатааммония при рН 5,1Выход: 0,33 г,По данным тонкослойной и высокоскоростной колоночной жидкостной хроматографии, полученный продукт не содержит примесей.Рассчитано,Х: С 51, 15; Н 6,00;И 13,05.СзоН 91 Я,Оз 8 СНСОгН НОНайдено,Х: С 50,83; Н 6,06,К 12,91,М Оф 53 0С з НзоИОэЯ: 1 ф) Р ф 6,3 (С=Ое 2).КК = 0,32, 0,65 , 0,641470199 10 Схема 2 Мха Ме укт от- омывают 40 4 (С 7 (С С 56 Меон),1, МеОН).16, Н 6,40;,(375 мл). Получен дают льдом и про в течение часа га держивая температ После этого че смесь в течение 5 аз т и разбавляют5 о П р и м е р 2 (см, схема 2)ВОС-РЬе (ИО) .Рго.НН 2(11) .ИОС-РЬе (ИОп).РгО.ОИе (6) (22,9 г)растворякт в метаноле (250 мл) и охлаждают полученный раствор льдом,после чего пропускают через него газообразный аммиак до насыщения. Затем колбу закрывают и оставляют прикомнатной температуре в течение7 дней, После этого реакционную смесьупаривают в вакууме и сырой продуктподвергают кристаллизации из этилацетата. По данным тонкослойной ивысокоскоростной колоночной жидкостной хроматографии, полученный раствор не содержит примесей.Т.пл. 176-178,5 С,о ИН НС 1 (12)Рго.МН(8,0 г)и метанола (20 млмл) и этилацетатный раствор охлажпускают через негозообразный НС 1, иУру -15 С,рез реакционнуюмин пропускаютее сухим эфиром(450 мл). Образующийся прод фильтровывают, тщательно пр эфиром и высушивают в вакууме на смесью РОи ИаОН. Выход 6,28 г (93% от теоретич,). Т.пл, 156-15 Ге 1 рд,5 (С=1, МеО Го 3 в - 15,3 (С=1, МеОН) ВОС-Туг, В-Мег. С 1 у. РЬе (Ю ) . Р Н (13),ВОС-Туг,П-Мег (0),С 1 у (5) (1,0 г) растворяют в диметилформамиде (20 мл) и охлаждают полученный раствор до -25 ОС, после чего к нему добавляют Н-метилморфолин (0,21 г) и изобутилхлорформиат (0,28 г) и интенсивно перемешивают смесь в течение 2 мин, поддерживая ее температуру равнойо-15 С. Затем к ней добавляют предварительно охлажденный до -25 С раствор РЬе (Ю).Рго.НН.НС 1 (0,71 г) и Я-метилморфолина (0,33 г) и перемешивают при -15 С в течение 2,5 ч.После этого реакционную смесь переносят в ледяную баню и обрабатывают 2 М КНСОз (2,5 мл) в течение 30 мин, Растворители отгоняют в вакууме а остаток распределяют между этилацетатом (270 мл) н водой (40 мл). Органическую фазу отделяют и промывают 5%-ным раствором лимонной кислоты (2 с 40 мл), 5%-ным раствором МаНСОз (2"40 мл) и водой (2 х 40 мл). Экстракт высушивают и упаривают досуха, Пос1470199 12 ЕР, мг/кг Испытуемое соединение Соединение примера Соединениепримера 3Морфин 40 О,1 0,12 0,054 50 где Х-ОМег, ОМег,(О),ле растирания остатка с эфиром получают 0,56 г продукта (353 от теоретич. выхода). Полученный продукт используют на следующей стадии без дополнительной очистки.5 Н,Туг.Р-Мег, (0).С 1 у,РЬе (ИО ),Рго,ЛН,(14),От ВОС-ТугЛ- Мег(0) .С 1 у.РЬе (ИО)10Рго. МН(О, 56 г) отщепляют з ащитнуюгруппу в молярной смеси НС 1 и уксусной кислоты (56 мл) в присутствиианизола (20 мл). После выдержки в течение 30 мин при температуре окружающей среды реагенты удаляют в ва"15кууме и полученный сырой продукт путем растирания остатков с эфиром,Полученный сырой продукт. подвергаютхроматографии на колонке 2,5 х 25 см,заполненной карбоксиметилцеллюлоэой.Элюирование осуществляют при линейном градиенте 0,005-0,2 М ацетатааммония при рН 5,1. После такой предварительной очистки пептид сновавозвращают в колонку 2,5 50 см, заполненную карбоксиметилцеллюлозой иосуществляют элюирование ацетатомаммония с линейно изменяющейся концентрацией от 0,005 до 0,1 М прирН 5,1. После удаления летучего бу.30фера с помощью проводимой несколько разсублимационной сушки получают чистыйпептид. Выход: 50 мг (91/ от теоретич.), По данным тонкослойной (2,7,8)и высокоскоростной колоночной жидкостной хроматографии полученныйпродукт не содержит примесей. Рассчитано,%: С 50,52, Н 6,05,; И 12,89.С 1,Н,Я,ОзБ СНэСО,Н 1 р 5 НфНайдено,Х: С 50,59, Н 5,96, И 12,97.П р и м е р 3. Н-Туг-ПМег-С 1 уРЬе(4 Ю)РгоИН получают согласно схеме, укаэанной выше. Продукт выделяют в виде хлористоводородной соли присоединения, а затем чистят на карбоксиметилцеллюлозе (СМС 52) градиентным элюированием буферными растворами уксуснокислого аммония (0,001. М до 0,5 М), После лиофилизации из водного раствора получают уксуснокислую соль присоединенияКХ: 0 52 , 0,83, 047 фЫ 1+8,1, (С=0,2 МеОН).Фармакологическая активность.Пептиды указанных примеров испытывали на следующие виды активности с помощью стандартных Фармакологических способов.Анальгезия в мышах при испытаниигорячей пластиной, причем пептидвводят посредством инъекции внутрьмозгового желудочка.Антидиарейная активность в крысах. В этом способе крысы голодаютв течение 24 ч, затем пептид вводятподкожно или орально, после чего через 15 мин дают орально касторовоемасло по 1 мл на крысу (ЕП, - 0,020,03 мг/кг).Для противокашлевого испытания,морских свинок подвергли воздействиюаэрозоля, содержащего 20 Х лимоннойкислоты, через 30 мин после введениясоединения (орально или подкожно).Подсчитывали число кашлей в течениепятиминутной экспозиции и усреднялизначения для шести животных в опыте(ЕР - 10 мг/кг р.о,),Анальгезия в мышах в испытаниис судорогой (модификация способаГендерсона с сотр.) при оральном введении пептида,Основное их назначение - лечение диареи.При испытании на крысах для синтезированных пептидов и морфина были пОлучены следующие значения ЕО (см. таблицу), характеризующие их анальгетическую активность,перорально внутривенно Испытываемые пептиды малотоксичны " при введении их по отдельности перорально пяти мышам в количестве 500 мг/кг ни одна из мьппей не умерла.Соединения по изобретению мало- токсичны, обладают высокой протнводиарейной, анальгетической и противокашлевой активностью,Формула изобретения Способ получения пептидов Формулы Н-Туг-Х-С 1 у-РЬе (4 МО ) Р го-ХН ,3 4 1470199 где У=МНОМе,и получаемый при этом.пентапептидформулыВОС-Туг Х-С 1 У-РЬе(4 КО)-РгоУ,в случае необходимости, если Т-ОМе,при обработке аммиаком заменяют ОМегруппу на аминогруппу, затем отщепляют защитную группу и целевойпродУкт выделяют в свободном видеили в виде кислотно-аддитивной соли. или их кислотно-аддитивных солей, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что трипептид формулы ВОС-Туг-Х-С 1 уОН,где Х-РМей или ПМеС(0)подвергают взаимодействию с дипептидом формулы Н-РЬе(400 а)РгоУ,Составитель В.ВолковаТехред М.Моргентал Корректор С,Черни Редактор О.Спесивых Заказ 1369/59ВНИИПИ Государственного113035,Тираж 339 Подписноекомитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР Москва. Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно"издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101