Способ получения d-фенилаланил-l-пролил-l-аргининальдегид сульфата

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНих РЕСПУБЛИН 61 К 37/02 С 07 К 5/08 ПИСАН188. Б ер Геде яр РТ 1977.ИЛАЛАНИЛ- СУЛЬФАТА кл. С-фенилаланил. зводст з олучения олил-Ьа ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(56) ОпйеСг М.А. и др,"Эее 1 яп ИьресЫдс .хпЬЬдгога оЕ апуогепьпсопчеггЫя епгуве: пеи с 1 ава о 2ога 11 у асг 1 че апг 1 ЬурегСепвчЬ:а 8 епгз" Яс 3.епсе, ч, 196, р.441,197Патент Венгрии Р 169870,07 С 103/52, опублик. ЯОИ 42 О аргининальдегида, проявляющего биологическую активность, что может бытьиспользовано в медицине. Цель изобретения - создание нового более активного и малотоксичного пептида.Его синтез ведут из блокированногоВос-группой указанного альдегида илиего полусульфата, который подвергаютдеблокированию обработкой 8-12"кратным эквивалентным количествам 512 н, Н БОа при 40-60 С в течение10-20 мин с последующей нейтрализа"цией раствора и выделением целевогопродукта. Выход 793, Го 1(-117 )аф 8,1 (с=1, в воде), брутто ф"лаС 1,Н,ОИ НБОа ЗНО 0,2 СаБОа,мол.м. 565,85. Новый пептид обладаетхорошей стабильностью при хранениив водных растворах, Так, в сравнениис известными солями указанного пепти".да антитромбиновая активность сохраняется до 180 дней против 5 дней притоксичности 1.Э =960 "2000 мг/кг.504 табл, 1442078Изобретение относится к способуполучения Р-фенилаланил-Ь-пролил.аргининальдегид сульфата - новогобиологически активного соединения,которое может найти применение в медицине,Цель изобретения - способ получения новых соединений в ряду малотоксичных пептидов, обладающих высокой 10антитромбогенной активностью, сохраняющейся в течение длительного времени при хранении в водных растворах. При осуществлении способа контроль 15за чистотой продуктов осуществляютс помощью хроматографии в тонком слоесиликагеля С (Реанал, Будапешт) вследующих системах растворителей:Этилацетат-пиридин"уксусная кисло 20та-вода 480: 20: б:11;Этилацетат-пиридин-уксусная кисло"та-вода 60:20:6:11;Этилацетат-пиридин-уксусная кислота"вода 30:20:6:11.25П р и м е р 1. Р-фенилаланилпролил-Ь-аргининальдегид сульфат.2,74 г (5 ммоль) трет-бутоксикарбонил-Р-фенилаланил-Ь-пролил-Ьаргининальдегид полусульфата раство 30ряют в 5 мл воды, при перемешиваниидобавляют 5 мл 10 н, серной кислоты,смесь нагревают до 50 С. Раствор пеоремешивают в течение 15 -мин при этойтемпературе, затем разбавляют 25 мл 35ледяной воды и с помощью твердогокарбоната кальция (примерно 2,25 г)устанавливают значение рН, равное6,5.Выпавший в осадок сульфат кальция 40отфильтровывают и промывают 2 разапо 5 мл водой, Фильтрат дважды встряхивают с 10 мл н-бутанола, концентрируют его при пониженном давлениипримерно до объема 30 мл, желательно 45фильтруют и лиофилизируют. Получают2,25 г (797,) указанного в заголовкесоединения, которое содержит 4,83сульфата кальция. 2=0,35-0,40,ГЫ 3 р =-117+81 (с=1, в воде).Вычислено, 7.: С 42,45; Н 6,77И 14,85; БО, 20,37; Са 1,41; НО 9,55.С,НО И, Н,БО, ЗН О 0,2 СаБО(мол,м, = 565,85)Найдено, Е: С 42,2, Н 6,9; Н 14,8555БО 19,8; Са 1,3, Н О 9,75Стадия 1. Трет-бутилокси-карбонилЛ-фенилаланил,-пролил-И -бензилоксикарбонил - Ь-артинин-пактам. 8,6 г (22 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-И "бензилоксикарбонил-Ьсаргинин-лактама суспендируют в 20 млоэтилацетата при 5 С и при перемешивании добавляют 40 мл 4 М содержащего этилацетат раствора соляной кислоты.Реакционную смесь при охлаждении ледяной водой перемешивают в течение 30 мин, затем разбавляют 100 мл охлажденного этилацетата, выпавший оса" док отфильтровывают, промывают этил" ацетатом и сушат над гидроксидом калия в вакуумном эксикаторе.ЯТаким образом полученный Б "бензилоксикарбонил-аргининлактам-хлоргидрат растворяют в 20 мл диметилфор" мамида и после охлаждения до "10 С добавляют 6,2 мл (44 ммоль) триэтиламина. Полученную суспенэию добавляют к следующему ангидриду. 7,25 г (20 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-Р-фенилаланил-Ь-пролина и 2,22 мл (20 ммоль) Н-метил-морфо лина растворяют в 20 мл диметилфоро мамида. Раствор охлаждают до -15 С и при перемешивании добавляют 2,64 мл (20 ммоль) иэобутилового эфира хлоругольной кислоты, потом спустя 5 мин добавляют вышеуказанный раствор диметилформамида. Реакцион" ную смесь далее перемешивают в течеоние. часа при - 15 С и в течение часа при 0 С. Затем разбавляют 30 мл бензола, выпавшие в осадок соли отфильтровывают и промывают ндважды по 10 мл бензола. Содержащий бензол диметилформамидный раствор разбавляют 50 мл воды и фазы разделяют. Водную фазу экстрагируют дважды по 1 О мл бензолом, затем объединенные, содержащие бензол растворы промывают последовательно трижды по 30 мл 10 Е-ным раствором карбоната натрия, 30 мл воды, трижды по 30 мл 0,5 н, серной кислоты и дважды по 30 мл воды, потом после высушивания над безводным сульфатом натрия выпаривают при пониженном давлении. Остаток после выпаривания растирают с петролейным эфиром, отфильтровывают, промывают петролейным эфиром и сушат на воздухе. Получают 9,65 г (767) указанного в заголовке соединения.2=0,81 - 0,89.1Стадия 2, Трет-бутилокси-карбонил- Р-фенилаланил,-пролил-М -Гензилокси 6карбонил,-ар гининал ьпе гид.акции катализатор отфильтровывают,промывают 30 мл 50 -ного водноготетрагидрофурана, затем концентрируют фильтрат при пониженном давлении 5до объема примерно 60 мл. Остатокэкстрагируют четыре раза по 40 млбутанолом. Если водная фаза содержитуказанный в заголовке продукт (К ==0,45-0,54), то добавляют 5 мл тетрагидрофурана и ее дважды-триждыэкстрагируют 40 мл н-бутанола, н-бутанольные фазы объединяют и выпари"вают досуха при пониженном давлении.Остаток после выпаривания растираютсо смесью 1: 1 диэтиловый эфир-диизопропиловый эфир, отфильтровывают ипромывают вышеуказанной смесью, потом сушат в вакуумном эксикаторе,Получают 4,4 г (80) указанного взаголовке продукта, К,=0,45-0,54.ГоЗ =-65 + 10 (с=1, в воде).Вычислено: С 54,43; Н 7,13;Б 15 23 БОс 8 71С,Н, ОЧ, 0,5 Нл 50 (551,64)Найдено,: С 54,5 Н 7,3;И 15,2; ЯО+ 8,7.П р и м е р 2. Получение П-фенилаланил-Ь-пролил-Ь-аргининальдегид ЗО сульфата.2 85 г (5 ммоль) трет-бутилокси 1Скарбонил-Э-фенилаланил-Ь-пролил-Б -карбокси-Ь-аргининальдегида растворя"ют в 5 мл воды, при перемешиваниидобавляют 5 мл 1 О н, сеуной кислоты. Зб Раствор нагревают до 50 С, в течение15 мин нагревают при 50 С, затемразбавляют мл ледяной воды и приохлаждении ледяной водой с помощью 40.твердого гидроксида кальция (необхо. димо примерно 1,6 г) устанавливаютрН равным 6,5. Выпавший в осадоксульфат кальция отфильтровывают ипромывают дважды по 5 мл водой.фильтрат экстрагируют дважды по 10 мл 4 В н-бутанолом, затем концентрируют припониженном давлении примерно до объема 30 мл, в случае необходимости отфильтровывают, наконец лиофилизируют.Получают 2,3 г (81 ) указанного в заб 0 готовке продукта, который содержит4 сульФата кальция. К=0,35"0,40.1 Ы 3 =117 + 1 (с=1, в воде)Исходное вещество получают следующим образом.55 6,4 г (10 ммоль) защищенного трипептидальдегида (пример 1, стадия 2)гидрируют в 100 мл 75 -ного водногоэтанола и в присутствии 1 г 102-ного 14420789,52 г (15 ммоль) защищенного трипептид-лактама (стадия 1) раство" ряют в 45 мл тетрагидрофурана прио-20 С и при интенсивном перемешивании добавляют содержащий 11,25 ммоль литийалюминийгидрида тетрагидрофурановый раствор ЬИ 1 Н(примерно 28 мл 0,4 М раствора). Течение восстановления контролируют с помощью тонкослой" ной хроматографии (К - значение лактама составляет 0,71-0,77, а альдегида " 0,31-0,39) и, если необходимо, можно добавлять дальнейшее количество раствора гидрида. По окончании реакции тетрагидрофурановый раствор осторожно подкисляют 0,5 н. серной кислотой до рН=З, затем, разбавляют водой так, чтобы вещество не осадилось (примерно 100 мл). Потом его дважды экстрапируют по 30 мл гексана. Водный содержащий тетрагидрофуран раствор трижды встряхивают с 75 мл метилен" хлорида, затем объединенные метиленхлоридные растворы промывают трижды по 10 мл 10 .-ным раствором карбоната натрия и дважды по 10 мл водой. После этого содержащий метиленхлорид раСтвор сушат над безводным сульфатом натрия и выпаривают при пониженном давлении. Остаток после выпаривания растворяют в 50 мл бензола, и раствор снова выпаривают при пониженном давлении. Растворение в бензоле и выпаривание повторяют еще один раз. Таким образом полученный остаток после выпаривания растирают с диэтиловым эфиром, отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром и сушат на воздухе. Получают 6,9 г (72 ) указан" ного в заголовке соединения К=0,3- 0,4.ГСтадия 3. Трет-бутилокси-карбонил-В-фенилаланил-.Ь-пролил-Ь-аргининальдегид полусульфат.6,4 г (10 ммоль) защищенного трипептид-альдегида (стадия 2) растворяют в смеси 50 мл воды, 50 мл тетрагидрофурана и 10 мл 1 н. серной кис" лоты, затем в присутствии 1 г 10 Х- ного палладия на активном угле в качестве катализатора гидрируют. За течением реакции следят с помощью тонкослойной хроматографии (К значение защищенного по своей гуани" дино-группе трипептид-альдегида составляет 0,95-1,0 и К - значение свободного трипептид-альдегида составляет 0,45-0, 54). По окончании ре 144207840 палладия на активном угле в качествекатализатора. За течением реакцииследят с помощью тонкослойной хроматографии (Е - значение защищенноготрипетидальдегида и И -карбокси-проо Бизводного составляет, соответственно,0,90-0,95 и 0,45-0,55), По окончанииреакции катализатор отфильтровывают,промывают 30 мл воды, затем фильтратконцентрируют при пониженном давлениидо объема 30-40 мл, Остаток разбавляют 100 мл воды, экстрагируют дваждыпо 20 мл метиленхлоридом и диофилиэируют. Получают 5,1 г (85%) указанно.го в заголовке продукта. В 0,45"1,0,55.Аминокислотный анализ: РЬе=0,96;Рто - 1 (в расчете на основу), Полученный в условиях примера 2 П-фенилаланил-Ь-пролил-Ь-аргининальдегидсульфат имеет состав С,Н,00 ЗН О "х 0,2 СаБО (мол,масса 565,85).Вычислено, %: С 42,45; Н 6,77М 14,85; БО 21,13; Са 1;43 2 БНО 9,55Найдено, %; С 42,30; Н 6,85;И 14,80; БО 20,90; Са 1,35;НО 9,70.П р.и м е р 3. П-фенилаланил-Ьпролил-Ь-аргининальдегид сульфат.Процесс ведут в условиях, описанных в примере 1 с той разницей, что2,74 г (5 ммоль) трет-бутилоксикар"бонил-Ь-пролил"Ь-аргининальдегид по,лусульфата растворяют в 10 мл 5 н.серной кислоты, раствор перемешиваютпри 60 С в течение 10 мин. Полученоный продукт идентичен продукту, полученному в примере 1.П р и м е р 4. П-фенилаланил-Ьпролил-Ь-аргининальдегид сульфат,Поступают по примеру 2 с той только разницей, что раствор, содержащий5 мл 12 н. серной кислоты перемеши".У45вают при 40 С в течение 20 мин,П р и м е р 5. Получение Фармацевтического препарата.Препарат в двух ампулах, которыйпригоден для 6-12-часового вливания,готовится следующим образом: 420840 мг П-фенилаланил-Ь-пролил-Ь-аргининальдегид сульфата в качествебиологически активного вещества и40-80 мг человеческого альбуминалиофилиэируют вместе, Содержимое таким образом лиофилиэированной ампулЫперед применением растворяют в 100200 мл стерильного, не содержащего пирогена, изотонического раствора поваренной соли.Найдено, что стабильность различ. ных солей П-фенилаланил-Ь-пролил-Ь" аргининальдегида в водном растворе, например в физиологическом растворе поваренной соли, очень различна, При проводимых исследованиях пептиды растворяют в концентрации 1 О мг/мл и изменение антитромбинной активности растворенных веществ .наблюдают в течение 180 дн. Растворы хранятопри 5 С. Значения активности устанавливают в системе, которая состоит из следующих компонентов: 0,2 мл 0,5%- ного фибриногена крупного рогатого скота в 0,9%-ном растворе поваренной соли; О, 1 мл буфера трис(оксиметил)" амино-метан-хлоргидрат-соляная кислота (рН 7,2), который содержит раствор пептида; 0,1 мл 7 Б стандартного человеческого тромбина (В 1 Н. Мэриленд, США), 10 ед./мл раствора.Время свертывания крови системы без пептида составляет 15, как определено в коагулометре "БсЬпйЬегСГОББ". Активность трипептидальдегид" ной соли оценивают как 100, если при конечной концентрации реакционной смеси 3,5 х 10М (в случае трипептидальдегид сульфата О, 175 мкг/мл реакционной смеси)1 было достигнуто 5- кратное относительное время свертывания крови.Результаты исследований представ-лены в табл. 1.Из нее следует, что в то время как первоначальная активность соответствующего хлоргидрата в физиологическом растворе йоваренной соли начинает падать спустя 5 дней, активность ацетата, цитрата, тартрата, а также тозилата начинает падать уже спустя несколько дней (подобными свойствами обладает также И 6-карбокси"производное трипептидальдегида); П-Фенилаланил-Ь-пролил-Ь-аргининальдегид сульфат сохраняет свою антитромбинную активность спустя 90 дн.При длительных (пролонгированных) исследованиях стабильности оказалось, что П-фенилаланил-Ь-пролил"Ь-аргининальдегид сульфатдаже спустя 180 дн в водном растворе еще стабилен и в твердомсостоянии он через 6 мес не теряет своей активности.Антитромбинная активность равна 100, если пептидальдегид в конечной концентрации реакционной смеси 3,5 х: соединение формулысигГ ъснг снг нн1уВОо-ВРгге-Ь-Рго-ггН-СН ггн-с1 ннг40сноЬ,ьгггаа или формулы снг Сн гкн45 . Вое-виге-Ь-Рго-нн-сн ггн-с гннсосндеблокируют, обрабатывая 8-12-эквивалентным количеством 5-12 н. сернойкислоты при 40-60 С в течение 1050 20 мин с последующей нейтрализациейраствора и выделением целевого продукта. 144е 10М вызывает пятикратное относительное время свертывания крови.Подобно, как в случае ацетата,изменяется антитромбинная активностьсоответствующего цитрата, тартрата итоэилата.Антитромбинная активность солейтрипептидальдегида, а также производного карбаминовой кислоты такжеисследовалась на человеческой плазме,которая лучше соответствует биологическим условиям в следующей системе:О, 2 мл человеческой цитратной плазмы;0,1 мл буфера три(оксиметил)-аминометан-хлоргидрат-соляная кислоты(рН=7,2), который также содержит пептидный раствор; 0,1 мл ЧЪ стандартно"го человеческого тромбина (01 Н, ВеСЬевйа, Мэриленд, США), 10 ед,/млраствора.Время свертывания крови системыопределялось без пептида в 15 с "коа"гулометре БсЬпй 1 гег-Сговв".Из данных табл.2 видно, что необходимое для удлинения вдвое времениконтрольногео свертывания крови количество пептида в случае ацетата ихлоргидратных солей зависит от загрузок и многократность также в случаекарбаминовой кислоты составляет .уд- .,военное количество количества трипеп.тидальдегид сульфата,Результат исследований ин вивопроизводных трипептидальдегидов представлен в табл.З, Антитромбинное действие Р-фенилаланил-Ь-пролил-Ь"аргининальдегид сульфата ин виво такжелочень, большое, При внутривенном иподкожном введении оно достигает действия вообще используемого в терапиигепарина, по сравнению с гепариномдостигается даже повьппенное действие(плюс-действие). В то время как гепарин перорально неактивен с помощью.трипептидальдегид сульфата при оральнои дозе 25 мг/кг можно достигатьтерапевтического действия (с помощьюкарбаминовой кислоты - только в дозе"50 мг/кг) .Данные по токсичности Р"фенилаланил-Ь-пролил-Ь-аргининальдегид сульФата положительнее, чем данные по токсичности ацетата, а также данныепо токсичности производного карбаминовой кислоты. В табл,4 приведенызначения острой токсичности, которыев случае трипептидальдегид сульфатав случае мьппей дают значение болеечем 2 г/кг.Иэ-за низкой токсичности и высо 10 кой активности Р-фенилаланил-Ь-пролил-Ь"аргининальдегид сульфата соотношение между лечебной и вредной дозбй лекарства 1 намного предпочтитель"нее, чем таковое остальных трипептид 1 б альдегидных.На основании исследований привнутривенном вливании собакам выявле-но, что цоэа для внутривенного влива"ния человеку составляет 1-2 мг/кг/ч.Проведенные испытания показали,что Р-Фенилаланил-Ь-пролил-Ь-арги"нинальдегид сульфат, полученный вусловиях предлагаемого способа, сое"динение малотоксичное, обладает высо"26 кой антитромбогенной активностью,сохраняющейся длительное время прихранении соединения в водных растворах.формула иэ о,бр етенияСпособ получения Ю-Фенилаланил"Ь-,30,пролил-Ь-аргининальдегид сульфатаФормулы1442078 Таблица Пептидальде гид Относительная активность спустя, дн0 5 10 15 20 40 90 70-50 60-40 40-30 40-30 40-30 35-25 30-20 90-60, 90-60 80-50 70-40 60-40 50-30 40-30 Р-фен-про-арг(СООН)-Н 100 80 60 50 30 25 20 100 100 100 100 100 100 100 0-фен-про-ар гТаблица 2 Пептидальдегид Относи" тельная активность 100 0,020 0-Фен-про-аргН Н БОР-Фен-проарг-(СООН)-Н 0,042 45 0-фен-про-аргН.2 СНСООН 0,065-0,140 35-14 Р"фен-про-аргН. 2 НС 1. 0,060-0)130 33-15 гепарин 0,105 19Значения, полученньй. с коммерческим 132,2,2 ед/мг,ЧБ РЬ ХУП/гепарином.Таблица 3 Доза, мг/кг/ч,внутривенноевливание Пеп тидал ьд е гид Доза, мг/кг Подкожно 1 Кролик Собака Кролик Собака Кролик Собака 0-фен-про-арг-Н,2 СН СООНР-фен-про-арг-Н,2 НС 10-фен-про-арг(СООН)-Н 100 100 100 3,0 10,0 6,0 50 50 25 25 Р-фен-про-а рг-Н, БО6,0 1,0 0,5 6,0 0,6 0,5 5,0 2,0 гепарин П р и и е ч а я и е. Терапевтическое действие характеризуется 1,5- кратным удлинением всего времени свертывания крови. Р-фен-про-аргН,2 СНСООН0-фен-про-аргН,2 НС 1 Необходимое для удаления вдвое времени свертывания крови количество реакцйонной смеси непосредственно после растворения пеп- тида1442078 2 Табли ца 4 ЛД мг/кг Пептидальдегид 38 - 960 1200 45230 1800 )2000 никаких литературных данных Данные по токсичности для других форм введения с соответствующей гарантией не приведены;При одночасовом внутривенном вливании в случае кроликов )ЛД е равна 58 мг/кг. Составитель В.ВолковаРедактор А,Долннич Техред А.Кравчук Корректор М,МаксимишинецФ Тираж 348 Подписное ВПИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5