Способ получения антибиотика-макролида

ЯО 1151 8 А СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 15 ) С 12 Р 1 Об ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬПИЙ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН К ПАТЕН ША) 39, 1970.(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИТИКА - МАКРОЛИДА общей формулы юл, Иф 14 и Балтц, Джен Мериел Вилд,но. и Герберт Эндрю Керст(СШ НО- СНГ ОН где 9 - СНО, или .сложный эфир при 3 в молекуле 0 ацет 4 отсутствует 0 иэов"ся в том, что щт 1. 12170 выращив ива условиях в пит и уг ерода и ой продук переводят в соедположениив положении ле уппа, заключаеа 1 гад 1 ае(72) Ричард ГенЮджин Томас Се СН ОН, или а этом, когда ильная группа, т алериановая гр амм Втгертоа ают в глуб ательной сред(71) Эли Лиллн Энд Компани(56) 1. Тетгабес 1 гоп 1 еИегз источники азот соли, выделяю и при необходи ким восстано где Ч - СНгОН этери фикацин минеральные40 45 Инокулированцую ферментативную среду 50 инкубируют в 50 мл бутылочках при 29 С в течение примерно 6 дней в закрытой трясучке, совершающей 300 об/мин.Ферментация ДМТ в ферментерах.Чтобы получить большой объем инокулята, 55 берут 1200 мл инкубированной среды и иссокулируют 946,4 л (250 галлонов) растительной средывторой стадии, имеющей следующий состав, %: 8 арЬу 1 ососсиз аигеия3055 1,Г)81 арЬу 1 ососсия аигеия209 Р 0.25Раясеиге 11 а пш 1 сосЫе5Раятеиге 11 а Ьепо 1 ус 1 са 12,5Мусор 1 аагпа 9 а 111 яерс 1 сигц 0,097Мусор 1 аагца Ьуорпеигпопае 0,195Мусор 1 азгпа ЬуогЬ 1 ц 1 з 0,78Способ получения антибиотика 23- цемццицо эилтилозина (ДМТ) и его п 11 оизвсщцьсх ицлсост. рируется следуюцсими примерами.П р и м е р 1. Ферментацця ЛМТ во встряхиваемой колбе.Лиофилиэоваццые таблетки Яс гертопзусея 1 гад 1 ае ИВВ 1 12170 диспергируют в 12 мл стерилизованной воды. Часть этого раствора (0,5 мл) используют для инокуляций растительной среды (150 мл), имеюсцей следующий состав,%:20Зерновая настойка 1,0Экстракт дрожжей 0,5Соевая мука грубогопомола 0,5Карбонат кальция 0,3Соевое масло (неочищенное) 0,45Обессоленная вода 97,25С другой стороны, растительную культуру 81 гертовусез Ггас 11 ае ИВВ 1. 12170 сохраняемую в 1-миллилитровых объемах в жидком азоте, быстро оттаивают и используют для инокуляции растительной среды. Инокулированцую растительную среду выдерживают в 500 мл колбах Эрлецмейера при 29 С и в течение 48 ч она находится в закрытой трясучке, совершающей 300 об/мин.35Эту инкубированную растительную среду (0,5 мл) используют для инокуляцци 7 мл продуцируюдсей среды, имеющей следуюппсйс состав,%;Свекольная патока 2,0Зерновая мука 1,5Рыбная мука 0,9Пшеничная клейковица 0,9Хлорид натрия 0,1(11 Н) НРО 0,04Карбонат кальция 0,2Соевое масло (неочищенное) 3,0Обессолецная вода 91,36 Зерновая цастоцка 1,0 Г;оевая масяяцая мука 05 Дрожжевоц экстракт 0,5 Карбоцат кальция 0 1 Соевое масло (неочищенное) Г 1,5 Лицетиц (неочищенный) 0,015 Вода 97,185 РН среды дово 1 сяс до 8,5 добавлением 50;ь ного раствора едкого патра.Эту растительную срену второй стадии ццкубируют в ферментере емкостью 1325 л (350 галлонов/в течение примерно 48 ч при 28 С при умеренном аэрировании и переме,ошцваццц,Приготовленную инкубированную среду второй стадли (545 л, т. е. 144 галлона) используют для ицокуляции 3785,4 л (1000 галлонов) стерильной ферменгационной среды; имеющей следующий составЯ Рыбпая лоука 0,875Зерновая мука 1,5Зерновая клейковица 0,875Карбонат кальция 0,2Хлорид натрия 0,1(1600 галлонов) в течение 8 - 9 дней при28 С. Бродящую среду аэрируют стериальньсмо,воздухом, поддерживая концентрацию растворенного кислорода в пределах примерно30 - 50%, и перемецпсвают стандартными мешалками со скоростью вращения 250 об/мин.П р ц м е р 2 Выделение ДМТ,Культуральную жидкость (3800 л), получен.ную в соответствии с примером 1, фильтруютиспользуя мелкий порошок. Мицелиальную лепешку промывают водой, а зти водные промывкидобавляют к фильтрату.рН фцльтрата доводят до 9,2, йспользуя 150%.ный раствор едкого патра (0,5 л) филфтрат затем экстрагируют 2000 л этилацетата,, К этилацетатному экстракту добавляют 450 лобессоленной воды и 6,4 кг одноосновногофосфата натрия и полученный раствор тпсательно перемешивают, рН раствора регулируютпримерно от 6,0 до 4,35, используя растворфосфорной кислоты (3300 мл, 2 ч воды на1 ч фосфорной кислоты). Водную фазу отде.ляют. рН обогащенной водной фазы доводятдо 6,5, используя 50%-ный водный растворедкого патра (700 мл).Полученный раствор концентрируют дообъема примерно 225 л в вакууме, рН это.го концентрированного раствора доводят до 59,2, добавляя 10%-ный водный едкий натр,(26 л) Полученный щелочной раствор выдерживают в течение восьми часов. Выделяющиеся .кристаллы отфильтровывают, промывают обессоленной водой (50 л) и сушат, получая примерно 8,6 кг продукта. Часть полученногопродукта (3 кг 1 .подвергают перекрнсталлизации из смеси ацетона - воды и получаютпримерно 2,07 кг ДМТ свободного основания, 15ДМТ размягчается; примерно при 132 Сон медленно плавится примерно до 150 С.Анализом установлено, что ДМТ приблизительно имеет следующий состав,%. углерод 61,водород 8,5, азот 2, кислород 28, следуюгцую 20эмпирическую формулу: С Н й 0а также молекулярную массу примерно742 (741 по данным масс спектрометрии),Максимумы поглощения приходятся на следующие частоты (см 1): 3634 (очень малый), 253559 (с уступом), 3423 (широкий), 2955(интенсивный), 1013. (с уступом), 984 (с ус.тупом), 926 (очень малый), 898 (оченьмалый) и 833 (очень малый).35УФ-спектр поглощения ДЫТ в нейтральномэтиловом спирте обнаруживает максимум"= 300,9).ДМТ-свободное основацие имеет,следующееудельное вращение:ос 1 О - 53,5 о (с 1, СНОН)Электрометрическое тнтрование ДМТ в66% ном водном димепшформамиде указывают на наличие титруемой группы с рК,примерно 7,25.45ДМТ-основание является растворимым в роде и в большинстве полярных органических растворителях, таких как ацетон, метанол, .зтанол, диметилформамид, хлороформдиме.0 тилсульфокстш. ДМТ-соли-аддукты кислотлучше растворяются в воде, чем ДМТ-основание.П р и м е р 3, Получение ОМТ(5-0.ми.коминозилтилонолида).ДМТ, приготовлешый в соответствии с методикой примера 2, растворяют в разбавленной соляной кислоте (соляную кислоту добавляли к воде до рН раствора 1,0), Получсннь 1 й раствор выдерживают в течение 24 ч при комнатной т.млературе и затем рН регулируют до 9,0 добавлением едкого натра. Этот щелочной раствор экстрагируют этил. ацетатом, цихлорметаном или хлороформом, Экстракт сушат под вакуумом и получают,П р и м е р 4, Получение ОМТ.ДМТ (500 г) приготовленный в соответствии с примером 2, измельчают в ступе и добавляют к обессоленной воле (1,5 л); рН поддерживают в пределах 3,5 - 7,5 при необходимости добавлением серной кислоты. Через 30 мпн весь ДМТ растворялся, рН раствора затем доводят до 1,4 и выдерживают раствор в течение 42 ч при 22 С. После стандартной обработки получают 366 г ОМТ, идентичность которого была подтверждена . сопоставлением с тонкослойной хроматографией известной пробы.П р и м е р 5. Получение дигидро-ДМТ (20-дигидро-демицинозилтилозина) .50 мг ДМТ, приготовленной в соответствии с примером 2, растворяют в водном растворе изопропилового спирта (примерно 40%, 25 мл). В 30%-ном водном. растворе изопро-, пилового спирта растворяют 20 мг борогидри; да натрия. 1 мл раствора борогидрида натрия добавляют к раствору, содержащую ДМТ. Полученную смесь перемешивают в те. чение 5 мин, рН регулируют до 7,5, добавляя фосфорную кислоту, и затем концентрируют в вакууме для удаления изопропилового спирта, .Затем к полученному водному концентрату добавляют воду до объема 25 мл, а затем добавляют 50 мл хлороформа. рН" водной фазы регулируют до 7,5. После экстракции отделяют хлороформ и вьшаривают досуха в вакууме, в результате чего получают дигидро-ДМТ.П р и м е р 6. Получение дигидро.ОМТ (20 дигидро 5-0-микалиноэтилтилонолида) .Дигидро-ДМТ, полученный в соответствии с примером 5, обрабатывают способом, описанным в примере 3, н получают дигицро- ОМТ. П р и м е р 7, Альтернативное получениеОМТ.ОМТ получают из ДМТ путем обработкиДМТ в ферментативном бульоне, в которомего готовили в присутствии слабой кислотыв соответствии с примером 3. ВыделениеОМТ достигалось процедура, аналогичнойтой, которая описана для ДМТ в примере 2.П р и м е р 8. 2.О.Лцетил-ДМТ,10 г ДМТ (13,5 ммоль) растворяют в260 мл ацетона и обрабатывают уксуснымангидридом (1,6 мл, 15,7 ммоль), добавляяпо каплям при перемешивании при комнатнойтемпературе. После перемешивания в течение7 15128818 ч растворитель выпаривают при понижен. (б) 5:4 толуола к этцлацетату (300 лттт)ном давлении. Остаток растворяют в 200 мл и (н) 1:1 толуола к этилацетату (1000 мл).этилацетата и экстрагируют насьпцецным раст- Получают 2,5 г (72%) 2; 23-ди-О-и опио.ворбм бикарбоцата натрия(2 х 200 мл). нцл.ДМТ,Органический растворсушат над сульфатом 5 П р и м е р 12, 2- О.Ацетил-0-пропцонатрия, фильтруют и выттаривают, Остаток ццл ДМТрастворяют в малом объеме этцлацетата, за- В 180 мл метцленхлорпда в 5 мл пиригружатот в колонку с силикагелем (Вотерс . дина растворяют 6 г (7,7 ммоль) 2 -О.Преп 500) и злюируют этилацетатом (4 л), .ацетцл-ДМТ ц обрабатывают 1,2 млФракции, содержащие целевой продукт, иден-О (9,2 ммоль) ангидрида проштоновой. кислоты)тифицируют методом тонкослойной хроматогра- добавляемого по каплям при комнатнойфии объединяют и выла ивают ос ха температуре. После перемешиванця в течение17 ч раствор разбавляют 300 мл толуола иП име выпаривают досуха прц пониженном давлении,Аналогичным спосббом 6,0 г (8,1 ммоль) т 5 Остаток растворяют в толуоле и экСтраги.ДМТ в 120 мл ацетона обрабатывают 1,2 мл руют цасьпценным раствором бикарбоната наг.о9,2 ммоль) ангидрида тРопионовой кисло- рия, Толуольный слой суша фсушат над сульфатом .ты, После обработки и хроматографирования натрия, фильтруют и выпаривают, Остатоквыделяют 3,7 г (57%) 2 т -О-пронионил-ДМТ, растворятот в малом объеме толуола, загру.П р р,-Д т. ацетил-ДМТ. 20 жают в хроматографическую колонку с силиП р и м е 10. 2" 23-Дц.О-ацетил-ДМТ.3 г ДМТ (4,05 ммоль) аство яют в) Растворяют в кагелем (300 мл), заполненную толуолом 90 мл хлористого метилена и 7,8 мл пири- зтилацетатом (: ) и элюируют одним литзтцлзцетатом (1:1)дина и об 1 забатыватот 1,4 мл (13,7 ммоль) ром указанного растворителя. Фракции, соангидрида уксусной кислоты, добавляемттго держащге целевой фпо каплям при перемешивации прц комнат методом тотткослотной температуре. После перемещивапия в те- няют, выпариватот при пониженном давлениичение 17. ч раствор разбавляют 15 мл толуолаи получают 4,5 г (70%) 2-О.аттетил.-0-про-и растворители выпаривают при пониженном пионил-дМТ.давлении, Остаток растворяют в малом объеме П р ц и е р 13. 2 -0-П2 -0- Пропттотилэтилацетатом, загружают в колонку с силика. 30 -ацетттттМТ.гелем. (Вотерс Преп 500) и элтоируют четьтрь . Атта 1 огттчтт об б б.налогцчцым образом обрабатывают 2 -О2 0мя литрами зтилацетата, получая 2,1 г сыРо- -проппонцл-ДМТ (1,5 г, 2 ммоль) в хлорис.го продукта. Этот материал растворяют втом лтетттлетте (45 ) 3,9минилтальном объеме толуола, загружают в с помощью 03 мл (2,9хроматографическую колонну с силикагелем сусттой кцслоть 1), По те.слойной хроматографией, объедцнятот и вы .0-Аттетцтт-ДМТ (26,5 г, 3,5 ммоль)паривают досуха, получая 1,6 г (64%) 2,23- Растнорятот в 75 мл хлористого метиленадигидро-О-ацетил.дМТ." 08 мл пирцдшта ц обрабатывают раствором0,56 мл (3,5 дтлтоль) фенплацетилхлорида иП име 11.2 -Д Р р . ,23-Дтт-О-пропцонцл-, 13 мл хлористого метттлетта, добавляемых по.3 ЩТ.45 .каплялт црц перемешинании. при комнатнойтемпературе. Спустя 1,5 ч смесь обрабатываютВ 90 мл метиленхлорида и 7,8 мл ци и Р дополнительным количеством фенилацетттлхло-дина растворяют 3 .г ДМТ (4,05 ммоль)рида АЫ мл) хлористом лтетилене (13 мй).и о ра атывают, мл (13,8 ммоль) ангид(13,8 ) - Спустя еше 1,5 ч исходный материал былрида пропионовой кислоты; добавляемого по израсходован (установлено тонкослойной х о.каплям при перемешивании при комнатной матографией). Затем Раствор выпаривают дотемпературе. После перемешцланття в течение суха лри поцижеттном давлении, остаток расг.ночи добавляют 15 мл толуола, ц раствоР Р воряют н хлористом метцлене ц зкс агивыпаривают досуха про поцижетптом давлении.насыщенным раствором бцкарбоната на ия,Остаток растворяют в 20 мл толуола загру О " " у . ад. фатом н трганцческцй слой сушат над. с льфатом н ткагелем (Е М О 500 )ерк о, мд) и элюируют ток растворяют в толуоле и хроматографиру-,(а) 3:1 толуола к зтилацетату (300 мл), ют на силикагельной колонке (Вотерс Преп1512 500).:Эк трагирование проводят при линейномгадтетгс толуола (4 л) и этилаиетата 14 л) цри соотношении 1:1. Фракшти, содержацтие пеленой продукт, обьепицякт и выттаривают, получая 1, г (35%)-О-Ацегич.23-0-фецил. 5 аиггт-ЛМТ, Из иредшсствуницих фракций так. же было лолуено 0,86 г (24%) 2 .О ацетил. 3,4 ди-О. фенилацетил.ДМТ.П р и м е р 5. 2.0-Ацетил 23.пропио. нлд Е.МТ (1,6 г, 1,9 ммоль) растворяют в О 95",-том метаноле 180 мл) и ттеремешивакт цри комнатной темттературе в течение 42 ч. Раствор выпаривакт досуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в малом объеме толуола, загружают в хроматографи. 5 чсскук колонку с силикагслсм (Е, Мерк 60, 200 мл) и элтоируют 2 л толуола этилацетата (1:1), Фракции, содержатцие целевой продукт, идецтифипирутот методом тоцкослойной хроматографии, объедицятот и выпаривают при ттони 2 р жецном давлении, получая 1,2 г (79 о) 23-0- -пропионил - ЛМТ.П р и м е р 16. 23-0-фенилацетил-ДМТ.0,6 г (0,67 ммоль) 2-0-апетил 23-0-фенилапетил-ЛМТ растворянт в 80%-ном водном растворе (50 мл) и энергично кипятят с обратным холодильником в течение 4,5 ч, Раствор охлаждаят до комнатной температуры и выпариватот досуха при пониженном давле-,нии, получая 0,39 г (68%) 23-0.фенилацетил -ДМТ.П р и м е р 17. 23,4 -ди-ФенилацетилЛМТ.2 0- Ацетил.23,4 .ди-О.фенилацетил-ДМТ (0,36 г, 0,36 ммоль) растворяют в 80% ном водном метаноле (30 мл) и кипятят с обрат. цым холодильником в течение 4,5 ч. Раствор охлажттают до комнатной температуры и выпариватот досуха при пониженном давлении, получая 0,29 г (84%) 23,4 -ди-О.фенилапетил -ЛМТ.П р и м е р 18. 2 -0 Ацетил,23,4 -три -0- пгэпиоттит-ЛМТ.2 -0- Апетил-ЛМТ (2 г, 2,6 ммоль) растворятот в 40 мл ацетона и 8 мл пиридина и обрабатывают раствором 40 мл ангидрида дропионовой кислоты в 20 мл ацетона, до. бавляя его по каплям при перемешивации и комнатной температуре. Перемешивание осуществляют в течение 5 дней, смесь выпаривают при пониженном давлении. Остаточное масло растворяют в этилацетате и экстрагируют насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органический слой сушат цад судьфатом натрия, фильтруют и выпаривают. Остаток растворяют 55 в малом объеме толуола и хроматографируют ца силикагеде (Вотерс, Преп 500). Колонку злюируют при линейном градиенте толуода 8(4 л) и этилапетата 14 л), Фракции, соттержа шие целевой продукт, объединяют, выпаривают и цолучатот 1,4 г (57%) 2 0 ацетил.3,23,4 .О.,Упро пиоцил. Е 1 МТ.П р и м е р 9, 3,23,4 .Три.О.цроцнонил- .ЛМТ.я20 Ацетил.3,23,4 три О.цропиоцил.ЛМТ (0,7 г, 0,74 ммоль) растворяют в 80%-том водном метаноле (55 мл) и кипятят с обрат.цым холодильником в течение 5 ч. Раствор охлажпакт и затем вьшаривают до водного юри пониженном давлении. 1 родукт экстраги.руют хлористым метштецом, органический слой отделяют, сушат цад сульфатом натрия, фильт.руют и вьшариватот при пониженном давлении досуха, получают 0,38 г (56%) 3,23,4 -три.О.. проц ионил. ЛМТ.П р и м е р 20. 2,4,23-Три-О-ацетил ЛМТ.10,0 г ЛМТ (13,5 ммоль) растворяют в 50 мл пиридица и обрабатывакт 5,8 мл (60,7 ммоль) уксусного ангидрида при переме. пптвании при комнатной температуре, После перемешивания в течение ночи растворитель вы. паривают при ттотптжеттном давлении. Остаточное масло растворяют в дииторметане и экстрагируют насыщенным .бикарбоцатом натрия; органический слой отделяют, сушат нап сульфатом натрия, фильтруют и выпариватот при пониженном давлении. Остаточный материал хромато.графируют на силикагеле (Вотерм Преп, 500), элюируют при линейном градиенте смеси толуола (4 л) и этилацетате и этилапетата (4 л) при соотношении 3:1.Фракции, содержащие целевой продукт, идентифицируют тоцкослойной хроматографией, объединяют и выпаривают при пониженном давлении, получают 4,5 г 2,423. три-ацетил ЛМТ.П р и м е р 21. 2 -0-Ацетил-О-фенокснацетил-ДМТ.2-0-Ацетил-ДМТ (2,75 г, 3,5 ммоль) растворяют в 75 мл дихлорметана и 0,8 мл пиридина и обрабатывают раствором 1,2 мл (88 ммоль) феноксиацетилхлорида в 25 мл дихлорметана, добавляя их по ;аплям при перемешивании и комнатной температуре. ф Через один час реакционную смесь выливают в насыщенный раствор бикарбоната натрия (200 мл) и отделяют органический слой, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают при пониженном давлении, Остаточную твердую пену загружают в хромато.графическую колонку с силикагелем, продукты разделяют и элюируют используя толуол.этилацетат (1:1) в качестве растворителя.1,5 г 2 -О-ацетил.0-феноксиацетнл-ДМТ.вы.деляют вместе с 0,55 г 2 -О-ацетил,ч -ди1151218 Составитель Г, СмирноваТех ред М.Пароцай Корректор А. Тяско Редактор С, Тимохина Тираж 525 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений н открытий113035, Москва, Ж, Раущская наб., д, 4/5 Заказ .2992 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 П р и е р 22. 2.0 Ацетил.0-(пара хлорфенчлапетил) .ДМТ,Лара -хлорфенилуксусную кислоту (4,3 г,25 ммоль) и 1 оксибензотриазол (5,4 г,25 ммопь) растворяют в 150 мл тетрагидрофурана. Раствор охлаждают в ледяной бане иобрабатывают 5,2 г (25,3 ммоль) дициклогексилкарбодимида. Реакционную смесь переме.щивают при ОС в течение 3 ч н затем помещают в холодильник на ночь, Смесь фильтру.юг, и фильтрат выпаривают при понижеНномс(2,8 ммоль) имидазола. Добавляют ацетондо объема 1235 мл и затем добавляют1,87 мл (12,8 ммоль) триэтнламина. Послеперемешнвания в течение 20 ч при комнатной температуре растворитель выпаривают припониженном давлении, остаток загружают вколощу с силикагелем и злюируют при градиенте толуола-этилацетата (4:1) и одногоэтилацетата. Получают 4,75 г 2 -0-ацетнлI23.0. (пара-хлорфенилацетил) -ДМТ,П р и м е р 23. 2 0-Ацетил.0-пропионил-ДМТ,2-О-Ацетил.ДМТ (1,0 г, 1,3 ммоль) растворяют в 30 мл пиридина и раствор обрабатывают 0,6 мл (4,6 ммоль) пропионовогоангидрида, добавляемого по каплям при пе.5 ремешивании и комнатной температуре. Через20 ч добавляют 3,0 мл (23 ммоль) про.нового антидрида и реакционную массу пере.. мешивают в течение последующих 26. ч пригкомнатной .температуре. Смесь разбавляют30 мл толуола н при пониженном давлениивыпаривают растворителн, Остаточное маслорастворяют в 50 мл дихларметане и экстра.гируют насыщенным раствором бикарбонатанатрия, фильтруют и выпаривают. Остаток 5 загружают в колонну с силикагелем (ВотерсПреп 500) и элюнруют при линейном гра.диенте толуола (4 л) н этилацетата (4 л).Сначала элюнруют 305 мт 2 .0-ацетил-;-ди-О.пропионил-ДМТ, а затем 286 мг 2 -О-аце.я20. тнл-О-пропионнл-ДМТ,Предлагаемый способ позволяет получитьантибиотик, обладающий определенным спек.тром антимнкробного действия, н может быть 25 использован для лечения сельскохозяйственных и друтих жвнотных,.