Способ получения антибиотика

Номер патента: 1151219

Авторы: Вальтер, Дзюнсуке, Ритиро

ZIP архив

Текст

(9) (1) 51) ТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ ГО Е ЗОБРЕТЕНИ Сиз НО(46) 15.04.85. Бюл (72) Вальтер Дание тер Патрик Куллен кава и Дзюнсуке То(53) 615.779,931(0 54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКАормулы а к л ю ч а ю щ и й с я в том,что шегерйошусез Ьа 1 зСед 11 АТСС 3ультивируют в питательной среодержащей источники углеродаа и минеральные соли, в глубиэробных условиях с последующимением целевого продукта из куальной жидкости и при необходереводом его в катионную соль1151219 Цель достигается тем, что согласно 5 способу получения антибиотика форму- лы Н ОН штамм 8 ггерСошусез Ьа 1 зге 411 АТСС 15 31812 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях с последующим вьщелением целевого продукта из культу ральной жщкости и при необходимости переводом его в катионную соль,Используемый для осуществления способа микроорганизм Яггергошусез Ьа 1 згед 11 выделен из образца почвы в Японии. Депонирован в Ашег 1 сап Туре Сп 1 гцге со 11 есг 1 оп под номером 31812.Штамм Бггергошусез Ьа 1 эсед 11 АТСС 31812 характеризуется следующими признаками. 30Культурально-морфологические призз ра наки.Агар дрожжевого экстракта - солодового экстракта - хороший рост, цвет от кремового до светло-желтова- З 5 того, умеренно повышенный, гладкий, загрубленный до морщин, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент отсутствует, 40Агар овсяной муки - умеренный рост, серый до коричнево-серого, от слабого до слегка повышенного, гладкий с небольшими белыми пятнышками; слабый воздушный мицелий, белый до светло-сероватого; обратная сторона такая же, как поверхность; растморимый пигмент светло-желтоватый.Неорганические соли - крахмаловый агар - умеренный рост, желтоватокоричневый до коричневого, жидкий, гладкий, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент отс .ствует, 5 ут 5 гиновыи агар -о слабого, тускадкий с небольИзобретение относится к микробиологической промьшленности и касается получения нового кислотного полиэфирного антибиотика,Аналогов в патентной и научнотехнической литературе не обнаружено. Глицерин - аспара рост от умеренного д ло-белый, жидкий, гл Цель изобретения - создание способа получения антибиотика. ОН1шими белыми пятнами; слабый воздушный мицелий; белый; обратная сторонатакая же, как поверхность; бе створимого пигмента.Тирозиновый агар Гордона и Смита -рост от слабого до умеренного, бесцветный до кремового, жидкий, гладкий, без воздушного мицелия; обратнаясторона такая же, как поверхность;без растворимого пигмента,Чапек-сахарозный агар - слабыйрост, бесцветный до тускло-белого,жидкий, гладкий, с небольшими белыми пятнами воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента.Глюкозо-аспарагиновый агар -умеренный рост, желтовато-серыйдо лавандово-серого, жидкий, гладкий,но слегка сморщенный вблизи края;воздушный мицелий светло-серый;обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент светло-желтый. Агар с кальциевой солью яблочной кислоты - слабый рост, бесцветный с тускло-белым краем, затопленный, гладкий с небольшими пятнами сероватого воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента.Казеиновый агар - умеренный рост, светло-коричневый, жидкий, гладкий до слегка загрубленного, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента. Агар Баннета - хороший рост, коричневый, повышенный, морщинистый, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент светло-желтоватый.25 Агар водной вытяжки - плохой рост, бесцветный до мутно-белого, жидкий, гладкий, с небольшими белыми пятнами воздушного мицелия, обратная сторона 40 такая же, как поверхность; растворимый пигмент отсутствует.Физико-биологические свойства.Меланин не образуется. Сероводород не образует, Желатин разжижает, 45 Крахмал гидролизует. Нитрат восстанавливает до нитрита. Ограниченный рост на целлюлозе Иенсена. Отсутствует рост на целлюлозе Левина и Шоенлайна, Нет разложения на обеих целлюлозных средах.Молоко не коагулирует, не пептонизирует.. Не усваивает каэеин, кальциевую соль яблочной кислоты и тирозин.На среде Нономуры использует глюкозу, арабинозу, ксилозу, плохо усваивает рафинозу; не успевает сахарозу,Агар Эмерсона - рост от умеренного до хорошего, светло-желтовато-коричневый до зеленовато-серого, жидкий до повышенного, гладкий до слегка загрубленного или возникающий как 5 мембранные чаши, которые нерегулярно 1сморщены, без воздушного мицелия, обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента.Питательный агар - рост от слабо го до умеренного, светло-желтоватый, жидкий, гладкий, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; нет растворимого пигмента, 15Желатиновый агар - рост умеренный, светло-желтоватьп, жидкий, гладкий, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента. 20Крахмаловый агар - хороший рост, кремовый, светло-желтоватый до светло-желтовато-коричневого, жидкий до несколько повышенного, гладкий, но сморщенный по направлению к краю, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента.Картофеле-морковный агар - умеренный рост, кремовый (2 са) с серова- З 0 тым до темно-серого краем, жидкий, гладкий, воздушный мицелий от серого до темно-серого; обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент отсутствует. инозтол, маннитол, фруктозу и рамнозу.На среде 1 БР В 9 импользует глюкозу, арабинозу, ксшюэу, и сахарозу,не усваивает фруктозу, инозитол,маннитол, раффинозу и рамнозу,При культивировании на картофелеморковном агаре в течение 15 сутмасса спор серого цвета, цепочкиспор прямые, искривленные, нерегулярно изогнутые или волнистые, изредкакрючковатые, от 10 до 30 спор вкаждой цепочке, редко менее 10; скосы овальные, от эллиптических достержнеобразных, 1-1,8 х 0,8-0,9 мкм,гладкие.ОХороший рост при 21-28 С, можетрасти и при 37-45 С.П р и м е р 1. Готовят стерильную среду следующего состава, г/л во.ды: церелоза 10; крахмал 20; дрожжевой экстракт 5; М Е УТТ (казеин ферментативного переваривания) 5; дикалийгидрофосфат 0,5; мясная мука 5;хлорид кобальта 0,002; карбонат кальция 4; рН среды 7,2-7,1.Культуру со скошенного агара переносят в ряд колб объемом 300 мл,каждая из которых содержит по40 мл стерильной среды указанногосостава, встряхивают на роторнойкачалке при 28-36 С в течение 3-4 сут.оАликвоту растущей культуры, достаточную для обеспечения 2 об.Е инокулята, переносят в 4-литровые ферментеры, каждый из которых содержит2 л стерильной среды следующегосостава, г/л воды: перелоза 10;У Е амин А (каэеин ферментативнопереваренный 5; крахмал 20; дрожжевой экстракт 5; карбонат кальция1; хлорид кобальта 0,002.Ферментацию ведут нри 30 С и перемешивании со скоростью 1700 об/мини степени аэрирования 1 Ч об. воздуха/Ч обсреды/мин. в течение 3-5 сут.Культуральную жидкость фильтруютпри нейтральном рН, фильтрат экстрагируют метилизобутилкетоном илин-бутанолом. Органическую фазу отделяют -от водной фазы и фильтруют дляудаления суспендированного материала.Твердое вещество на фильтрате суспендируют в метаноле, отфильтровывают,метанол выпаривают и остаток экстрагируют тем же растворителем. Экстракты объединяют и выпаривают в вакууме, получают вязкое масло. Его сус 1151219пендируют в гептане, перемешиваютс силикагелем и фльтруют. Остаток нафильтре повторно промывают гептаном,продукт ступенчато элюируют чистымхлороформом, смесью хлороформа и 5этилацетата и чистым этилацетатом,После проведения тонкослойной хроматографии и биоанализа фракцийактивные фракции объединяют, выпаривают в вакууме и остаток повторнохроматографируют для получения антибиотика 53607 в виде твердого вещества.Инфракрасный спектр (таблеткас КВг), мкм: 2,95; 3,42; Ь,ОО; 6,37;6,85; 7,14; 7,30;7,65; 7,90; 8, 1,9,05;11,40 р 11,75; 13.,25. Антибиотик растворим в хлороформе, этилацетате,метиловом спирте и метилизобутилкетоне; не растворим в воде.П р и м е р 2, Готовят инокулятпо примеру 1, но используют 700 млсреды в каждой колбе, инокулят ферментируют во встряхиваемой колбе при28 С в течение 3-4 сут, смешиваютв двух бутылях с боковыми отводами.Ферментер емкостью 6435 л, содержа- .щий 4542 л стерильной среды, указаннойниже, инокулируют 6 л (0,12) указанногоииокулянта. Ферментационная среда,г/л; церелоза 1,0; казеин 5,0; крахмал 5,0; карбонат кальция 3,0; хлорид кобальта 0,002; жидкость послезамачивания кукурузы 5,0 мл; вода до д1 л рн 6,9-7,0,0Ферментацию ведут при 28 С приаэрировании и перемешивании со скоростью 1700 об/мин. Через 120 ч ферментер выгружают. Весь бульон экстрагируют 946 л метилизобутилкетона, слоифаз разделяют в экстракторе Подбельняка .и органическую фазу концентрируют в вакууме, получая 30,3 л масла.Масло дополнительно концентрируют 45в вакууме на роторном испарителе..Остаточный сироп суспендируют в гептане, перемешивают с силикагелем ифильтруют, промывая несколько разгептаном, Промытый остаток на фильтре обрабатывают по примеру 1, получая300 г масла, которое растворяют внебольшом количестве хлороформа,раствор выливают на Фильтр (Лэпп),содержащий 3,5 кг силикагеля, и си зликагелевый слой последовательнопромывают порциями по 19 л хлороформа,этилацетата и ацетона. Фракции исследуют методом тонкослойной хроматографии. Найдено, что продукт почти полностью содержится в этилацетатнойфракции. Прочие фракции выбрасывают,этилацетатную фракцию выпаривают досуха в вакууме, получая 150 г концентрата. Концентрат дополнительноочищают хроматографически на колонке8,0 х 1000 см, заполненной тем же силикагелем, суспендируя концентрат вэтилацетате. Колонку элюируют этилацетатом, отбирая литровые фракции,со скоростью 60 мл/мин. Фракции, содержащие продукт, собирают и выпаривают в вакууме, получая 85 г продукта.Этот продукт пропускают через колонку, содержащую 1 кг смолы СефадексЭль-Эйч, элюируют метанолом соскоростью 25 мл/мин. Отбирают фракции объемом 300 мл. Объединяют Фракции, содержащие продукт, и выпариваютрастворитель, получая 30 г твердоговещества, которое растворяют в 500 млхлороформа, растворпромывают равнымобъемом 5 Е-ного натрийдигидрофосфатного буфера, который доводят до рН4,5 добавлением 857-ной фосфорнойкислоты. Отделяют органический слой,промывают его 500 мл 5 Х-ного динатрийгидрофосфатного буфера, которыйдоведен до рН 9,0 добавлением 1 н.раствора гидроокиси натрия. Затемэкстракт высушивают над безводнымсульфатом натрия и выпаривают досухав вакууме. Твердый остаток растворяютв ацетоне и дают выкристаллизоватьсяв холодильнике. Кристаллы собираютпутем фильтрации и высушивают приглубоком вакууме при комнатной температуре, получая 14 г натриевой соли соединения антибиотика 53607 ст.пл. 199-204 С,Оптическое вращение:1151219 Составитель Г. СмирноваТехред О. Ващишина Корректор А. Обручар Редактор О. Колесникова Заказ 2191/47 Тираж 525 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 калия, по указанной методике аналогично получают калиевую соль соединения антибиотика 53607 (аналогичнополучают аммониевую соль, используяв указанной методике дигидрофосфат 5аммония и диаммоний гидрофосфат).Часть полученной натриевой солисоединения антибиотика 53607 растворяют в этилацетате, добавляют водуи доводят водную фазу до рН 4,5, подкисляя ее 857-ной фосфорной кислотой.Отделяют органический слой, высушивают сульфатом натрия и выпариваютв вакууме, получая соединение 53607в виде свободной кислоты с т.пл. 1584-95 С,Данные элементного анализа получают для образца, высушенного в течение ночи в глубоком вакууме при комнатной температуре: С 64,69; Н 8,91; 20И 0,0.Найдено, что эта кислота не растворяется в воде; растворима в хлороформе, этилацетате, метаноле и метилизобутилкетоне 25(м) +49,7 (С=1, в метаноле).Уф-спектр:% ,= 233 нм (в метаИК-спектр (таблетка с КВг), мкм: 3 ц2,95; 3,45 6,00 6,85 7,28; 8,13;11,48.Бариевую соль получают встряхиванием 2,0 г свободной кислоты, растворенной в 80 мл этилацетата, с равным объемом .воды, содержащей 2,4 гоктагидрата гидроокиси бария. Разде- Ф ляют слои, промывают органическуюфазу свежим раствором октагидратагидроокиси бария, высушивают сульфатом натрия и выпаривают в вакууме,получая соль соединения антибиотика 53607,Кальциевую соль, готовят по указанной методике, но используя гидроокиси кальция вместо октагидратагидроокиси бария.П р и м е р 4. По методике примера 1 используют 4%-ный раствор инокулята в 4-литровых ферменторах, каждый из которых содержит 2 л следующейстерильной среды, г/л:церелоза 10;кукурузный крахмал 10," соевая пудра10; карбонат кальция 1; ферментируемое твердое вещество кукурузы 5;хлористый натрий 5; рН 7,0.Ферментацию проводят в течение2 сут при 36 С и перемешивании со скоростью 1700 об/мин при продувке воздухом со скоростью 2 об/1 об бульона(/мин. Весь бульон экстрагируют хлоро-.формом и обрабатывают по примеру 1,получая соединение антибиотика 53607в виде смеси его натриевой, калиевойи кальциевой солей. Когда указанную методику повторяют, но вместо церелозы используют в ферментационной среде глицерин, а также рыбную муку или муку из семян хлопка вместо ферментизируемого твердого вещества кукурузы и проводят ферментацию при рН 8,0, 28 фС в течение 6 сут, то получают практически те же результаты.

Смотреть

Заявка

3464034, 14.07.1982

Пфайзер, Инк

ВАЛЬТЕР ДАНИЕЛЬ КЕЛМЕР, ВАЛЬТЕР ПАТРИК КУЛЛЕН, РИТИРО СИБАКАВА, ДЗЮНСУКЕ ТОНЕ

МПК / Метки

МПК: C12P 1/06

Метки: антибиотика

Опубликовано: 15.04.1985

Код ссылки

<a href="https://patents.su/5-1151219-sposob-polucheniya-antibiotika.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения антибиотика</a>

Похожие патенты