Способ получения холестеринэстеразы

13 9 аель Нель аульанг Гр(ФРГ) 62927 1978.686,1976 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ СПИ САНИК ПАТЕНТУ 2966345/28-13, 296634615.08.802933646.7, Р 2933648(71) Берингер Маннхайм Гмб(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНЗСТЕРАЗЫ, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма Рзецдошопаз на питательной среде,содержащей минеральные соли, фосфатный буфер и индуктор с последующимвыделением фермента из культуральнойжидкости и/или клеток, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, вкачестве продуцирующего микроорганизма используют штаммы Рзепйопюпаззрес. 1)БМ 1281 или Рзепдошопаз зрес.ВБМ 1280, а в качестве индуктора -лецитин или соевый лецитин в количестве 0",5-2 Е от массы среды.1 1151Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения холестеринэстеразн. Известен способ получения холестеринэстеразн Я , предусматривающийкультивирование продуцирующего штаммаЯосагдга сЬо 1 евгего 1 гсцщ ЮККЕР 5767или ЯКИ. 5768 на питательной среде,содержащей необходимые минеральные 10соли и йндуктор - холестериновыйэфир или холестерин в количестве1-10 г/л и экстракт дрожжей с поСледующим выделением фермента. Иаксимальная активность фермента - 49,2.Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности и достигаемому положительному эффекту являетсяспособ получения холестеринэстеразн2., предусматривающий культивирова Оние продуцирующих штаммов Рвецдошопав Г 1 цогевсепв КУ 3955, 4032 .и т,д,на питательной среде, содержащей минеральные соли, фосфатный буфер ииндуктор - холестериновый эфир споследующим выделением фермента изкультуральной жидкости и/или клеток.Согласно способу используют пита-тельную среду, содержащую, гл:холестериновый эфир 5, кукурузный ЗОэкстракт 2, ЮаЮ 2, К НРС 1,И 8804 7 Н 0 2Активностьфермента - 17.Известным способам присущ общийнедостаток - низкая активность фер 35мента.Цель изобретения - повышение активности целевого продукта,Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу получения 40холестеринэстеразн, предусматривающему культивирование продуцирующегомикроорганизма Рвецдощопав на питательной среде, содержащей минеральные соли, фосфатный буфер.и индуктор 5с последующим выделением ферментаиз культуральной жидкости и/иликлеток, в качестве продуцирующегомикроорганизма используют штаммыРвецйошопав врес. ЭБИ 1281 или Рвецдощопав врес. ВБИ 1280, а в качестве индуктора - лецитин или соевыйлецитин в количестве 0,5-2% от массысреды,Применяемые в соответствии с изобретением микроорганизмы являютсяочень похожими и обладают следующиепризнаки: грамотрицательный; обяза 0,1 мл 0,1 мл 5,0 мл1,5%7,0 Культивирование производили при 30 С в качалочной колбе при соблюдении аэробных условий. Через 2 суток достигается активность приблизительно 1500 ч/л (раствор и биомасса: субстрат : холестерилолеат),тельно аэробный; желтоватые колонки на агаре из пептонов мяса рост прио9 25, 30 и 37 С; отсутствие роста при10, более 41 зС; размер клеток от 0,8 до 1 мкм, от 2 до 4 мкм; подвижность, 1 орйоггдсй Ье 8 е 1 ре 1 г; склонность к образованию цепей, отсутствие спор или продолжительных стадий: цитохром - оксидаза +; ката- лаза + ; индол-; нитрит-; желатина-; моносубстрат - деструкция: адонит +; цитрат +; галактоза +; глюкоза +; изонит +; лактоза +; маннит +; манноза +; салицин +; сорбит +,Процесс культивирования ведут ваэробных условиях при 15-45 С, предпочтительно между 25 и 35 С, используя посевные культуры, выращенные на качалке или на воздухе - РцщЬегвкультуры. Иаксимальный выход достигается после 1-2 суток культивирования.П р и м е р 1. Штамм Рвецйощопавзрес, ВАМИ 1280, перенесенный из охлажденной до низкой температуры ампулы в пробирку со скошенным агаром, предварительно культивировали в течение двух суток в основной культуральной среде при 30 С в аэробных условиях (качалочная колба) и затем в количестве до 10% пересевали в среду, которая имела на 1 л воды следующий состав:Двузамещенный фосфорнокислый натрий 7 гОднозамещенный фосфорнокислый калий 3 гХлористый аммоний 1 гХлористый натрий 0,05 г1%-ный раствор хлорного железа0,2%-ный раствор хлористой меди 0,1 мл1%-ный раствор сернокислого цинка10%-ный раствор хлористого кальция 1,0 мл12%-ный раствор сернокислого магнияСоевый лецитинрНЗаказ 2191/47 Тираж 525 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 Примерно такой же выход получали в том случае, когда при прочих равных условиях вместо Ряецйотпопаз зрес. ВБМ 1280 применяли Рзецйощопав зрес. ВБМ 1281. 5П р и м е р 2. Из культурального раствора, полученного в соответствии с примером 1, выделяли центрифугированием нерастворимую клеточную массу и применяли ее для определения хо лестеринового эфира. Определение производили в соответствии со следующей схемой реакций: Для измерения применяли следующиерастворы:25 17 41. Фосфатный буфер 0,5 М, рН 7,5, 0,47 тезита.2, Холестеринолеат с = 4 в тезитдиоксане (ч/ч = 1/ 1) .3. ЯО примерно 0,6 м (5 мл пергидрола/100 мл).4. Каталаза (0,01 мг белка/мл).5. Холестериноксидаза (мин. 50 ч/мл).6. Культуральный раствор (примерно 5000 ч/л, 1:5 разбавленный НО, 0,01 мл тест).Для измерения 2,95 мл раствора 1 смешивают с 0,02 мл раствора 3.Через 5 мин добавляют 0,01 мл раствора 6 и 0,02 мл раствора 5 и спустя 1 мин инициируют реакцию добавлением 0,1 мл раствора 2.Расчет осуществляют по формуле3 12 5 1000---- -Ь Е/мин = ч/л культу -15,5 0,01рального раствора.Таким образом, предлагаемый способ позволяет значительно повысить активность холестеринэстеразн.