Способ отсчета микродозы при прецизионной микроинъекции водного раствора в микрообъект пневматическим давлением и устройство для его осуществления

(22) Заявлено 270378 (21) 2594794/28-13 Р 1 М л г А 61 М 5/20 с присоединеиием заявки М Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(088, 8) Дата опубликования описания .200380(72) Авторы изобретения Е, Г, Иванов, В.Т. Ларин и 10. А, Попов Специальное конструкторское бюро биологического приборостроения АН СССР(54) СПОСОБ ОТСЧЕТА МИКРОДОЗЫ ПРИ ПРЕЦИЗИОННОЙМИКРОИНЬЕКЦИИ ВОДНОГО РАСТВОРА В МИКРООБЪЕКТПНЕВМАТИЧЕСКИМ ДАВЛЕНИЕМ И УСТРОЙСТВО ДЛЯЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ, Йзобретение относится к медицинской технике, а именно к электрофизиологической аппаратуре для исследовани я микрообъектов, н апример н ервныхклеток и тканей.Известен способ отсчета микродозы при прецизионной микроинъекцииводного раствора в микрообъект 1 .Заполнение кончика микропипеткипри этом способе водным растворомпроизводится эа счет капиллярныхсил при опускании кончика микропипетки в,инъецируемый раствор. Выдавливание дозы в микрообъект (клетку)производится давлением воздуха, подаваемого в микропипетку. Величинаинъекцируемой дозы определяется какобъем конуса по формулеЧ= - пг нфз20где г - радиус н ачального положениямениска;Ь - высота инъецируемого столбажидкости в коническЬм кончике микропипетки,Известный способ осуществляетсяс помощью устройства, которое имеетмикропипетку, пневматический крандля подачи и снятия давления, манометр для замера внешнего давления,регулятор внешнего давлени я, ми крбскоп с окуляр-микрометром для отсчета дозы,Однако по этому измерение диаметра кончика микропипетки, соответствующего начальному и конечному положению мениска, производится с большой погрешностью, равной половине цены деления шкалы отсчетного устройства окуляр-микрометра, что оказывается при отсчете инъецируемых доз малой величины порядка 1010 мл, когда для отсчета используется зона кончика микропипетки с внутренним диаметром 1-2 мкм, а диаметр выходного отверстия составляет 0,1-0,5 мкм. Так как измеренные диаметры при расчете величины дозы учитываются в квадрате, а длина перемещения мениска в прямой зависимости, то диаметры конического кончика микропипетки, соответствующие началу и концу Перемещения мениска инъепируемого раствора, должны быть измерены с высокой точностью, но при измерении диаметров такого порядка оптическими средствами величина погрешности соизмерима с их величиной, а поэтому ошибка в измерении дозы может достигать 100-200.45 где. г - радиус выходного отверстияконического острия микропипетки.Кроме того, после определения конусноати К рассчитывают давление воз- р духа Р,подаваемого в микропипетку, соответствующее заданному объему микродозы ч по формуле:3 вводят водный раствор в микрообъектПод давлением воздуха Р,Кроме того, устройствоществления способа отсчетазы йри прецизионной микроинводиого раствора в микрообьжено редуктором давления, свыходом регулятора внешнегоа кран для подачи и снятиявыполнен трехпозиционным, п для осу- мнкродоъекции 6ект снабвяэанным сдавления,давленияричем 6 Целью изобретения является повышение точности отсчета мнкродозы,а также снижение рабочих давлений" " "при микроинъекции.Цель достигается тем, что приосуществлении способа отсчета микро,доэы при прецизионной микроинъекцииводного раствора в микрообъект после заполнения конической части кончикамикроипетки инъецируемым раствором повышают давление воздуха до.величины, соответствуЮщей началу-перемещения мениска в направлении ккончику микропипетки, рассчитывают:кончика микроципетки К по зависимости г 4 АР,Нгде о - коэффициент поверхностногонатяжения на границе инъецируеьий раствор - собственный пар;20Р - давление, соответствующее началу перемещения менискаинъецируемого раствора вконическом острие микропнпетки; 25Н - высота от мениска до кончи, ка острия микропипетки;затем рассчитывают давление Р , соответствующее останову мениска в моменТ., когда в кончике микропипетки 3 Оостанется заданная величина микродоэы Ч после приложения этого давления, по формуле2 ос35й,1-Рки, подав это давление внутрь микропипетки, вытесняют избыток инъецируемого раствора из микропипетки,после чего вводят ее в мнкрообъект 4 Ои подают внутрь микропипетки давлеъние Рз , определяемое по зависимос- ти его дополнительный вход соединенпосредством пневмопровода, снабженного манометром, с выходом редуктора давления,На фиг. 1 изображено устройстводля осуществления способа отсчетамикродозы при преэиционной микроинъекции водного раствора; на фиг. 2 кончик микропипетки; на фиг. 3положение кончика микропипетки, введенного в микрообъект; на фиг. 4 и,5 - схемы, иллюстрирующие способотсчета микродозы.Широкая часть микропипетки 1 устройства (фиг, 2) должна иметь диаметр1-3 мм и длину 10-60 мм. Первое сужение 2 микропнпетки имеет угол нанолона 15-20 , после этого следуетпостепенно сужающийся до несколькихмикрон участок 3, имеющий длину 8-15 мм.Угол наклона этой части настолькомал, что можно считать этот участокцилиндрическим.Участок 3 переходит в коническоеострие 4 с конусностью порядка 1:8,1:10. Внутренний диаметр выходногоотверстия 5 кончика микропипеткинаходится в пределах 0,1-1 мкм, Чемтоньше кончик, тем меньше можетбыть травмирован микрообъект привведении в него микропипетки, Такимобразом, внутренняя полость 6 кончика микропипетки имеет цилиндрическую переходящую в коническую формуИикройипетка (фиг,. 1) кончик ко/торой опущен в сосуд 7 с инъецируемым раствором, установленным на столике 8 с окуляром-микрометром микроскопа, широкой частью жестко игерметично закреплена в держателе 9,который жестко установлен, например,на трехкоординатном микроманипуляторе 10, позволяющем вводить кончикмикропипетки в инъецируемый растворили в микрообъект. Штуцер 11 держателя гибким трубопроводом 12 связанс выходом 13 трехпоэиционного крана 14 для подачи и снятия давления,Отверстие 15 поворотной части трехпозиционного крана 14 попеременносвязывает выход 13 (а, следовательно н внутреннюю полость микропипетки) либо с атмосферой (верхнее полокение отверстия 15 - атмосфера),либо через дополнительный вход 16с выходом понижающего редуктора 17давления через пневмопровод 18 ипрецизионный манометр 19 (горизонтальное положение отверстия 15 отсчет), либо с регулятором 20 внешнего давления посредством пневмопровода 21, тройника 22 и пневмопровода23 (нижнее йоложение отверстия 15инъекция), Причем для установкидозы необходимо давление порядка0,5-2 атм, устанавливаемое с высокой точностью, а для инъецированияиэ кончиков диаметров 0,2-0,5 мкмеа.аяеаяКК 721107 2 А.р=эЧ, К2,1 2(К к.де уЖ Нсом основанияЯ; - ПРля 3 к половина объема парас .радиусом В. Р --2 А хпреобразований.,2 Й 14 ос 2 хКи - : - , Х Р = -н р,н1 д порядка 15-5 атм, которое может бытьустановлено с меньшей точностью,Способ осуществляется следующймобразом. Для определения конусности устанавливают кран в положейиеатмосфера, опускают кончик микропипетки в инъецируемый раствор(фиг. 1), за счет капиллярных силинъецируемый раствор заполняетвнутреннюю полость конического острия и частично цилиндрическую частькончика микропипетки (положеиие/1 мениска, фиг. 4) (наблюдение зазаполнением можно производить подмикроскопом). Положение крана 14при этом - атмосфера,. Затемпереводят кран 14 в положение .отсчет и, постепенно повышая давление воздуха, переводят мениск инъецируемой жидкости в положение 1,Затем замеряют оптическими средствами, например, с помощью окуляр-мик.рометра МОВвысоту Н от менискадо острия,По давлению Р 1 и высоте Н определяют конусность где В - внутренний радиус кончикамикропипетки в сечении поположению 1;аС - коэффициент поверхностногонатяжения на границе инъецируемый раствор - собственный пар.Так как инъецируемый раствор и внутреннее содержимое большинства биообъектов представляют собой сильно разбавленные водные растворы, вследствие чего их граничное поверхностное натяжение практически равно нулю, а вода практически полностью смачивает чистую поверхность стекла (т.е, угол смачивания равен нулю), то капиллярное давление, которое необходимо преодолеть для перемеще" ,ния мениска, зависит от радиуса капилляра и эта зависимость выражает,я формулой р 2 в " в условиях полйного смачивания.В связи с малым углом конуса, внося незначительную погрешность в измерение радиуса В, принимаем й = Й, где Й : отрезку ОА (фиг. 4), йричем отрезок ОА перпендикулярен образующей конуса (в действительности Р2 сф.- а не В , но вследствие малогор екугла конуса можно для упрощения расчетов принять, что ВПосле уого, как определена конус- ность К = - , задаются объемом дозые Ч, и находят дав)ение Р, ему соответствующее по формуле Эта формула выводится следующим образом (фиг. 4). Объем дозы у =Пй Н ---з; ПЙ5 х к 2 Х х- объем конуса с РадиуКн уравнениянахедни к а 1д (-2,( К пользуясь зависимостью определяет Р и после получаем к2 о(Ч,К2,1-2,1 КЕсли повысить давление внутри микропипетки с Ря до Рх, отсчитав егопо образцовому манометру с ценой деления 0,025 атм (кран в положении .З 5 отсчет), кончик микропипетки опу щен либо в инъецируемый раствор, либо в питательную среду, в котором . находится биообъект, что удобнее, избыток инъецируемого раствора выда О ется из микропипетки через выходное отверстие в кончике, а в кончике мик. ропипетки останется заданная доза Ч инъецируемого раствора, Теперь, что-бы выдавить заданную дозу, например 45 в цитоплаэму, микрообъекта, следуетввести кончик микропипетки в цитоплазму, кран поставить в положениеинъекция и подать давление Рз( Г к где х - радиус выходного2 оС 50 отверстия микропипетки. Для выдавливания всей дозы требуется. давлениейоСРи р, однако это давление подавать не следует в связи с возможнос 1,55 тью попадания вохдуха в цитоплазмувслед за дозой инъецируемого раствора. Целесообразно внести незначительную псгрешность в величину дозы,уменьшив Рз на величину порядка 5,но искхпсчить воэмсжность попаданиявоздуха в цитоплазму.Радиус выходного кончика микропипетки может быть определен одним изизвестных методов,После проведения инъекции кончикюкропипетки выводят из мркрообъек,04 2 9 0,1 1.0 14,9 0,18 0 0 зу Ча в цитоплазмуют кончик микропиа кран ставят вФера давливают микрод после чего выним петки из объекта положение атмо где р - да остановке м конусности. из формулыъ усечеВи 22П ( тветствующееопределениила выводитсяенного конуса) .а с основаниявлениеениск+В), нРл ЯК /2. Щ Подставляя эти для Ч 2, решая р , получим ачения в формулу внение относительнс рим мкмжд с вн за 30 петки ка 0,5 мк ого натяж 75 дин/см рялась ок установле 70 Рб,Резуль в табл. 2 ставлены опыт а та, выключают подачу воздуха, а кран ставят в положение атмссфера(фиг; 1) . П р и м е р . Проводилась инъекция дозы 7 = 10 мкм в воду из микаропипетки с внутренним диаметром кончика 0,5 мкм (г = 0,25 мкм). Предварительно теоретически было доказано и практически проверено, что Для установки дозы на манометре у танавливалось давление 1,70 кг/см, при этом кснчиК микропипетки был опущен в воду, это давление подавалось в широкую часть микропипетки, в результате чего устанавливалась доза 10 мкмПри подаче дав 3ления порядка б атм вся вода из ко чика выходила в воду в сосуде, за исключением небольшого количества, оставшегося в самом кончике острия дляг = 0,25 км дин ИХЛОВ 7 аам. 0,25 а =.:. Устройство обес ку заданной величи Р по образцовому не, установленном счет, и следоват определение конусн установку заданной ветствующей давлен жении крана инъе вает подачу высоко прохождения мениск раствора к самому его остановку. После определен вышеописанным мето давление воздуха Р щее объему микродо чик микропипетки в тановив это давлен(положение крана печивает установны давлений Р, манометру при;крав положение отельно, точное ости и точную дозы Ч , соотию Р; а при полокция обеспечиго давления для а инъецируемого кончику острия и ия конусности К дом определяютсоответствуюзы Ч, водт цитоплазму и, усие на манометре 19лотсчет), выинъекция в воду и в цитоплазму гигантского нейрсна ь 1 ппаеа заупа 11 е прсисходит при одинаковых давлениях. Результаты опыта представлены в табл. 1 (в Формулы подставлены значения коэффициента поверхностного натяжения А. для воды = 73 дин/см.Высота Н отсчитывалась по окуляр-микрометру МОВ, установленному на микроскоп БИОЛАМ 70 Рб.Т а б л и ц а 1 е р . Инъецировалась до воды в воду из микропиутренним диаметром кончиКоэффициент поверхност ения брался для воды Высота Н (фиг, 5) замеляр-микрометром МОВ, нЫм на микроскоп ВИОЛАМФормула из етени Ч. Ер 16,75 А водный раство лением воздух вв50 по в микрообъектра хностногоице инъецисобственны коэффициент пове натяжения на гра руемый раствор пардавление, соотвечалу пер мещения инъецируемого ра ническом острие ки; где Аствующее на мениска твора в ко- микропипетег 65 поПосле введения кончика микропидетки в микрообъект редуктором 17 на манометре 19 при положении крана 14 отсчет устанавливалось давление 1,45 атм, которое одновременно подавалось в микропипетку,благодаря чему выдавливалась заданная доза ЗО мкм .устройство обеспечивает замер дав лений Р и Р с точностью до 0,012 атм, следовательно отсчет дозы производится также с высокой точностью, ибо точность отсчета дозы определяется точностью замера давле нийрирЭтот сйособ,отсчета микродозы обеспечивает высокую точность. дозирования, отмечается простотой осуществления в производстве и значительно повышает производительность труда исследования (до 20 инъекций в 1 ч). 1, Способ отсчета микродоэы при прецизионной микроинъекции водного раствора в микрообъект пневматическим давлением, включающим эаполнейие конического кончика микропипетки вод ным раствором, введение.его под давлением, определение величины микродоэы как объема конуса, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности отсчета микродозы, после заполнения конической части кончика микропипетки инъецируемым раствором, повышают давление воздуха до .велнчины, соответствующей на-. ,чалу перемещения мениска в направлении к кончику микропипетки,рассчитывают конусность внутрейней поверх" ности кончика микропипетки К по зависимости:4 АК- -Н - высота от мениска до кончка острйя микропипетки;атем рассчитывают давление Р, сответствующее останову мениска вмент, когда в кончике микропипеткостанется заданная величина мИкроэы Ч после приложения этого давлния, по формуле2 осЧ,К2,1-2,1 Ки, подав это давление внутрь микрпипетки, вытесняют избыток инъецируемого раствора иэ микропипеткипосле чего вводят ее в микрообъеМ подают внутрь микропипетки давние Р, определяемое по зависимор (2 ф.з Г- радиус выходного отвконического острия ми р петки.пособ по п. 1, о т л и ч а юя тем, что, с целью сниже- . очих давлений при микроинъексле определения конусности К ывают давление воздуха Р, мого в микропипетку, соответе заданному объему микродозы ормуле; ни я споее микрон для поометр я, регукроскоп ичаюбжено ным с выавления, давления ричем динен снабжен 3. устройство осуществлесоба по пп. 1 и 2, содержащпипетку, пневматический крадачи и снятия давления, мандля замера внешнего давленилятор внешнего давления, мис окуляр-микрометром, о т лщ е е с я тем, что оно снаредуктором давления, связанходом регулятора. внешнего да кран для подачи и снятиявыполнен трехпоэиционным, ио дополнительный вход соесредством пневмопровода,: ,11;.;,: ; ::;7,2.1107гного манометром, с выходом редуктора давления.Исто 1 ники инФормации,йринятые во внимание при экспертизе 12 1, Приборы и методы для микроэлектродного исследования клеток.АЯ СССР Пушино 1975, с. 141, 145и 146 игр ФжФ оставитель Л. Соловьевехред Н.Бабурка Корректор Г. Решетник ктЬр В. Трубченк Заказ 26/5 е Киск 5 лиал ППППатент , г. Ужгород, ул. Проектная,Тираж 673 ЦНИИПИ Государственного по делам изобретений 3035, 1".осква, Ж, Рауш